In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
מחלת לב נשארת הגורם המוביל בעולם כיום ושיעורי התמותה נותרו כמעט ללא שינוי בשני העשורים האחרונים (American Heart Association). יש צורך קריטי בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות למניעה או להפוך אי ספיקת לב בצורה יעילה. אסטרטגיה מבטיחה אחת היא טיפול המבוסס על תאים בעקבות ההתפתחות המהירה של תאי גזע ביולוגיה 1. בהקשר זה, עלות לכל קליק multipotent יכול להיות מקור מצוין לתא הטיפול בשל היכולת שלהם להתרבות, אך מחויב רק לבידול שושלת לב. לכן, שיטה יעילה וחזקה כדי ליצור ולבודד עלויות לקליק הוא בעלת חשיבות רבה ללימודי טיפול בתאי לב.
פרוטוקול זה מתמקד בעלויות לקליק העוברית זוהו במהלך עובר ואיך הדור שלהם מESCs המוקדמים. עלות לכל קליק שונים היה מבודד מלב עוברי ובוגר, אפילו מעצם קישואים 2. במהלך התפתחות עובר, morphoge העצםחלבונים מגנטיים (BMPs), חברי כנפיים-סוג משפחת אתר האינטגרציה MMTV (Wnts) ואותות קטרים לגרום המחויבות של Mesp1 + mesoderm multipotent 3. Mesp1 + תאים אז להתמיין המחירים לקליק העובריים 4. עלות לכל קליק אלה מסומנים בדרך כלל על ידי HCN4, homeobox NK2 5 (Nkx2-5), homeobox Isl LIM 1 (Isl1), T-תיבה 5 (Tbx5), ו2C הגורם משפר myocyte (Mef2c), יוצרים שדות לב ראשוניים והשני, ו לתרום לחלקים הגדולים של לב במהלך cardiogenesis 5-10. עלות לכל קליק שני Nkx2-5 + וIsl1 + / Mef2c + מסוגל להתמיין cardiomyocytes, תאי שריר חלק (SMCs), ותאי האנדותל 5-8. כך העלויות לקליק אלה יהיו להצמיח כלי דם של הלב, כמו גם רקמות לב והם מקור תא אידיאלי לטיפול מבוסס תאי לב. כתוצאה מכך, יצירת מחירים לקליק במבחנה הייתה מוקד מחקר עיקרי במחקרי לב וכלי דם. מאז יש לי ESCs יכולת הרחבה בלתי מוגבלתnd מייצג את תאי ICM בשלב הבלסטוציסט, בידול של ESCs לעלויות לקליק העוברית הבאים העובר הטבעי נחשב גישה הגיונית ויעילה להשגת המחירים לקליק.
אחד גישה מיושמת באופן נרחב כדי להשיג מחירים לקליק מESCs היא כדי לצבור ESCs ל -11 EBS. כדי לשפר את יעילות הבידול, גורמים כימיים וצמיחה מוגדרות המבוססים על הידע של התפתחות לב היו בשימוש 12-14. עם זאת, אין סמנים מובהקים לקליק, במיוחד לא סמנים על פני קרום תא, המקובלים בתחום. כדי לטפל בבעיה זו, ESCs מתוכננים לציון Isl1 + או Mef2c מחירים לקליק + ונגזרים שלהם עם כתבי ניאון באמצעות מערכת / loxP Cre. Recombinase cre הוא דפק בתחת שליטתו של יזם / משפר Isl1 / Mef2c. RFP השתנה ניאון חלבון או גן YFP מונע על ידי אמרגן מכונן יכול להיות מופעל על ידי כריתה של קודון עצירת flox עם recombinase cre(ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP או RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP) 5,6. ברגע שESCs נבדל לעלויות לקליק שדה הלב השניה, cre מונע אמרגן / משפר Isl1 / Mef2c יפעיל את כתבי ניאון ויכולים להיות מועשר מחירים לקליק על ידי FACS לטיהור. בקצרה, שיטת צבירת EB משמשת ליצירת בידול ESC. כדי לשפר את יעילות בידול, מטופלים התאים המובחנים עם חומצה אסקורבית (AA) וגורמי גדילה כגון BMP4, Activin וVEGF 13,15. פרוטוקול זה מאפשר בידול חזק ויעיל CPC באמצעות עכבר והן ESCs אדם.
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Name | Company | Catalog Number |
FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
Knockout SR | Life technology | 10828028 |
Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
DMEM | Life technology | 11965118 |
NEAA | Life technology | 11140050 |
GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
N2 | Life technology | 17502048 |
B27 | Life technology | 12587010 |
Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
IMDM | Life technology | 12440061 |
Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
Pyruvate | Life technology | 11360070 |
Dispase | Life technology | 17105041 |
Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
BSA | Life technology | 15260037 |
Trypsin | Life technology | 25200056 |
Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
VEGF | R&D | 293-VE |
Bmp4 | R&D | 314-BP |
ActivinA | R&D | 338-AC |
bFgf | R&D | 233-FB |
Fgf10 | R&D | 345-FG |
mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |