胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

心臓疾患は、今日の世界で主要な原因のままであり、死亡率は、過去20年間（米国心臓協会）に事実上変わっていない。効果的に、心不全を予防または逆転するための新規な治療戦略を開発するための重要な必要性がある。一つの有望な戦略は、幹細胞生物学¹の急速な発展以下の細胞ベースの治療である。この点では、多能性のCPCは増殖だけ心臓系統への分化にコミットする能力のために、治療のための優れた細胞源である可能性があります。したがって、クリック単価を生成し、単離するための効率的かつロバストな方法は、心臓の細胞療法の研究のために非常に重要である。

このプロトコルは、初期胚発生とどのように彼らの世代のESCからの間に識別胚のCPCに焦点を当てています。各種のCPCにも骨髄²から、胚および成体の心臓から単離されている。胚発生時には、骨のmorphoge電磁タンパク質（BMP）、ウィングレス型MMTV組込み部位ファミリーメンバー（のWnt）と節点の信号がMesp1 ⁺多分化中胚葉³のコミットメントを誘導する。 Mesp1 ⁺細胞はその後、胚のCPC ⁴に分化する。これらのCPCは、一般的にHCN4でマーク、NK2ホメオボックス5（Nkx2-5）、カルチのLIMホメオボックス1（ISL1）、T-ボックス5（TBX5）、及び筋細胞エンハンサー因子2C（MEF2C）、一次および第二の心臓フィールドを形成されており、心臓発生^5-10の間に心臓の主要な部分に貢献しています。 Nkx2-5 ⁺及びISL1 ⁺ / MEF2C ⁺両方のCPCは、心筋細胞に分化することができる、平滑筋細胞（SMC）、および内皮細胞^5-8。したがって、これらのCPCは、心臓血管系、ならびに心臓組織を生じさせると細胞ベースの心臓療法のための理想的な細胞源であるであろう。その結果、in vitroでのCPCを生成する心血管研究における主要な研究の焦点となっている。 ESCは、無制限の拡張容量aを有しているのでND胚盤胞段階でICM細胞を表し、自然の胚発生以下の胚のCPCへのESCの分化は、クリック単価を取得するために論理的かつ効果的なアプローチと考えられている。

ESCのからのCPCを得るための1つの広く適用のアプローチは、EBを¹¹にESCのを集約することです。分化効率を向上させるために、心臓の開発の知識に基づいて定義された化学的および成長因子は^12-14使用されてきた。しかし、広く分野で受け入れられている明確なCPCマーカー、特に無細胞表面マーカーは、存在しない。この問題に対処するために、ESCのはISL1 ⁺またはMEF2C ⁺クリック単価とのCre / loxPシステムを用いた蛍光レポーターとその誘導体をマークするために設計されている。 CreリコンビナーゼはISL1 / MEF2Cプロモーター/エンハンサーの制御下で落札された。構成的プロモーターによって駆動される修正された蛍光タンパク質RFPまたはYFP遺伝子のcreリコンビナーゼでFLOX停止コドンの切除により活性化され得る（ISL1：CRE;-のpCAG-FLOX-STOP-FLOX GFPまたはRFP / ISL1-CRE。Rosa26YFP / ^{MEF2C-CRE。Rosa26YFP）5,6。} ESCは第二の心臓フィールドのCPCに分化されると、ISL1 / MEF2Cプロモーター/エンハンサー駆動CREは蛍光レポーターを活性化するとのCPCをFACS-精製によって濃縮することができる。簡単に説明すると、EB凝集法は、ESCの分化を開始するために使用される。分化効率を高めるために、分化した細胞は、アスコルビン酸（AA）およびBMP4、アクチビンAとのVegf ^13,15などの増殖因子で処理される。このプロトコルは、マウスおよびヒトESCの両方を使用して、堅牢で効率的なCPCの分化を可能にする。