Распространение<em> Homalodisca coagulata вирус-01</em> Через<em> Homalodisca vitripennis</em> Культура клеток
Summary
Здесь мы приводим протокол для распространения Homalodisca vitripennis клетки и HoCV-1 в пробирке. Среду удаляли из HoCV-1 положительных культур и РНК, выделенная каждые 24 ч для 168 часов. Сотовый живучесть количественно путем окрашивания трипановым синим. Целые вирусные частицы были извлечены после инфицирования. Извлеченные РНК оценивали количественно путем Qrt-PCR.
Abstract
Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis) является весьма vagile и многоядны насекомое найти по всему юго-западе США. Эти насекомые являются преобладающими векторы Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), ксилемы ограниченной бактерия, которая является возбудителем болезни Пирса (PD) виноградной лозы. Болезнь Пирса является экономический ущерб; Таким образом, H. vitripennis стали мишенью для стратегии управления патоген. Dicistrovirus определены как Homalodisca coagulata вируса-01 (HoCV-01) была связана с повышенной смертностью в H. vitripennis населения. Потому что клетка-хозяин требуется для HoCV-01 репликации, культура клеток обеспечивает единую среду для целевого репликации, которая логистически и экономически ценным для производства биопестицидов. В этом исследовании, системы для широкомасштабного распространения H. vitripennis клетки через культуре ткани была разработана, рредоставление вирусную механизм репликации. HoCV-01 был извлечен из целых насекомых тела и использовали для инокуляции культурный H. vitripennis клетки при различных условиях. Культуральную среду удаляли каждые 24 ч в течение 168 часов, РНК экстрагировали и анализировали с Qrt-PCR. Клетки окрашивали трипановым синим и подсчитывали количественно клеток живучесть с использованием световой микроскопии. Целые вирусные частицы были извлечены до 96 часов после заражения, которое было время точка определена как до возникновения полный крах культуры клеток. Клетки также подвергаются флуоресцентной окраски и просматривать с помощью конфокальной микроскопии для исследования вирусной активности на F-актин привязанности и ядер целостности. Вывод этого исследования является то, что H. vitripennis клетки способны культивируются и используются для массового производства HoCV-01 на подходящем уровне, чтобы позволить производство биопестицида.
Introduction
Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis Germar 1821) была определена в качестве основного вектора Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), возбудителя болезни Пирса виноградной лозы (PD) в Северной Америке 1. Насекомое населения управления быстро стал основным направлением научных исследований в целях борьбы с этой страшной проблемы в виноградарско промышленности в Калифорнии и по всей южной части Соединенных Штатов. Положительным смысле, одноцепочечной РНК вируса, принадлежащий к семейству Dicistroviridae, Homalodisca вирус-01 coagulata (HoCV-01) был определен в дикой H. населения vitripennis и показано, что увеличение смертности в тех популяциях 2-4, в то время как понижение сопротивляемости насекомого к инсектицидам.
Разработка методов для эффективного заднего инфицированных H. vitripennis к взрослой жизни в лабораторных условиях было трудно, потому что <eм> H. vitripennis имеют различные сценические конкретных потребностей в питании, которые требуют различные растений-хозяев 5-8. Конкретные объекты обязаны задней живой H. vitripennis в США; Поэтому, культуры клеток является более экономичным и жизнеспособной альтернативой, а также все более важным для HoCV-01 обнаружения и репликации 2,9. В то время как основные методы для создания клеточных культур H. vitripennis описаны эти методы еще не были использованы для промышленного производства биологических средств защиты, таких как вирусы 2.
Общая цель из следующих процедур является создание высокой концентрации HoCV-01, пригодного для использования в качестве агента биологической борьбы. Вирусной репликации требуется живую клетку, поэтому успешно культивируя и оптимизации H. vitripennis культуры является жизненно важным для прогресса производства выгодные уровни вируса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рост беспокойства в отношении притока инвазивных сельскохозяйственных видов привели к увеличению спроса на новых методологий по защите от новых вредителей и патогенов. В центре внимания профилактике заболеваний и управления включает в себя управление патогенных векторов и было осн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
