Voortplanting van<em> Homalodisca coagulata virus-01</em> Via<em> Homalodisca vitripennis</em> Cell Culture
Summary
Hier presenteren we een protocol om Homalodisca vitripennis cellen en HoCV-1 propageren in vitro. Medium werd verwijderd uit HoCV-1 positieve kweken en RNA geëxtraheerd elke 24 uur gedurende 168 uur. Cell overlevingsvermogen werd gekwantificeerd door trypan blauw kleuring. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd na infectie. Geëxtraheerde RNA werd gekwantificeerd door qRT-PCR.
Abstract
De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis) is een zeer vagile en polyfage insect gevonden in de zuidwestelijke Verenigde Staten. Deze insecten zijn de belangrijkste vectoren van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), een-houtvaten beperkt bacterie die de veroorzaker van de ziekte van Pierce (PD) van wijnstok. De ziekte van Pierce is economisch schadelijk; aldus, H. vitripennis hebben een doel voor pathogeen management strategieën worden. A dicistrovirus geïdentificeerd als Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is geassocieerd met een verhoogde mortaliteit in H. vitripennis populaties. Omdat een gastheercel nodig HoCV-01 replicatie, celkweek verschaft een uniforme omgeving voor gerichte replicatie die logistiek als economisch waardevol voor biopesticide productie. In deze studie, een systeem voor grootschalige vermeerdering van H. vitripennis cellen via weefselkweek ontwikkeld, providing een virale replicatie mechanisme. HoCV-01 werd geëxtraheerd uit hele lichaam insecten en gebruikt om gekweekte H. inoculeren vitripennis cellen op verschillende niveaus. Het kweekmedium werd elke 24 uur gedurende 168 uur, RNA geëxtraheerd en geanalyseerd met qRT-PCR verwijderd. Cellen werden gekleurd met trypaanblauw en telde tot cel overlevingskansen te kwantificeren met behulp van een lichtmicroscoop. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd tot 96 uur na infectie, waarbij het tijdstip bepaald voordat totale celkweek ineenstorting opgetreden was. Cellen werden ook onderworpen aan fluorescentiekleuring en bekeken met behulp van confocale microscopie om virale activiteit op de F-actine gehechtheid en kernen integriteit te onderzoeken. De conclusie van deze studie is dat H. vitripennis cellen kunnen worden gekweekt en gebruikt voor massaproductie van HoCV-01 op een passend niveau productie van een biopesticide mogelijk.
Introduction
De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis Germar 1821) is geïdentificeerd als de belangrijkste vector van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), de veroorzaker van de ziekte van wijnstok (PD) Pierce's in Noord-Amerika 1. Insect beheer bevolking heeft snel de focus van het onderzoek worden bij dit verwoestende probleem om de wijnbouw-industrie te bestrijden in Californië en over de zuidelijke Verenigde Staten. Een positief-sense, enkelstrengs RNA-virus behoort tot de familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is vastgesteld bij wilde H. vitripennis populatie en aangetoond dat de sterfte te verhogen in deze populaties 2-4, terwijl het verlagen van de weerstand van het insect om insecticiden.
Ontwikkeling van methoden om effectief achter besmet H. vitripennis naar volwassenheid in een laboratorium setting zijn moeilijk omdat geweest <em> H. vitripennis verschillende fase-specifieke voedingsbehoeften die verschillende gastheerplanten 5-8 vereisen. Specifieke voorzieningen nodig zijn aan de achterzijde voor live H. vitripennis in de Verenigde Staten; Daarom celkweek economischer en een alternatief, en steeds belangrijker voor HoCV-01 detectie en replicatie 2,9. Terwijl elementaire methoden voor het vaststellen van celculturen van H. vitripennis beschreven, deze methoden zijn nog niet gebruikt voor commerciële productie van biologische bestrijdingsmiddelen, zoals virussen 2.
De algemene doelstelling van de volgende procedures is een hoge concentratie van HoCV-01 geschikt voor gebruik als een biologisch bestrijdingsmiddel te produceren. Virale replicatie vereist een levende cel, waarvan de reden waarom succes cultiveert en het optimaliseren van H. vitripennis culturen is essentieel voor de voortgang van de productie van winstgevende niveaus van het virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stijgende bezorgdheid over de instroom van invasieve landbouwgewassen hebben geleid tot een toenemende vraag naar nieuwe methodieken om te verdedigen tegen nieuwe plagen en pathogenen. Een focus van ziektepreventie en-beheer omvat het beheer van de ziekteverwekker vectoren en was het primaire doel van deze studie. Economie spelen een vitale rol in de beslissing om dit soort biopesticide om pathogeen vectoren te beheren in de landbouw, omdat de praktische toepassing moet zijn grote hoeveelheden over grote gebieden, maar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
