نشر<em> Homalodisca coagulata فيروس-01</em> عبر<em> Homalodisca vitripennis</em> الثقافة خلية
Summary
هنا نقدم بروتوكول لنشر خلايا Homalodisca vitripennis وHoCV-1 في المختبر. تمت إزالة المتوسطة من HoCV-1 الثقافات الإيجابية والحمض النووي الريبي المستخرج كل 24 ساعة عن 168 ساعة. وكان كميا البقاء على قيد الحياة الخلية تلطيخ التريبان الأزرق. تم استخراج جزيئات الفيروس كاملة بعد الإصابة. وكان كميا الحمض النووي الريبي المستخرج من QRT-PCR.
Abstract
التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis) هو حشرة vagile للغاية ومتعددة العائل جدت في جميع أنحاء جنوب غرب الولايات المتحدة. هذه الحشرات هي ناقلات الغالبة من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، وهي بكتيريا محدودة الخشب الذي هو العامل المسبب للمرض بيرس (PD) من الكرمة. مرض بيرس غير ضار اقتصاديا؛ وبالتالي، H. أصبحت vitripennis هدفا لاستراتيجيات إدارة الممرض. ارتبط وdicistrovirus يدعى Homalodisca coagulata فيروس-01 (HoCV-01) مع زيادة في الوفيات H. السكان vitripennis. لأنه مطلوب الخلية المضيفة لHoCV-01 التكرار، توفر زراعة الخلايا بيئة موحدة للنسخ المتماثل المستهدفة التي هي لوجستيا واقتصاديا قيمة لإنتاج المبيدات الحيوية. في هذه الدراسة، ونظام للنشر على نطاق واسع من H. وقد تم تطوير خلايا vitripennis عن طريق زراعة الأنسجة، صroviding آلية تكاثر الفيروس. تم استخراج HoCV-01 من الحشرات الجسم كله ويستخدم لتطعيم H. مثقف خلايا vitripennis على مستويات مختلفة. تمت إزالة مستنبت كل 24 ساعة ل168 ساعة، وتحليل الحمض النووي الريبي المستخرج مع QRT-PCR. تم صبغ الخلايا مع الأزرق التريبان وعدها لتحديد البقاء على قيد الحياة الخلية باستخدام المجهر الضوئي. تم استخراج جزيئات الفيروس كلها تصل إلى 96 ساعة بعد الإصابة، التي كانت نقطة زمنية مصممة على أن تكون قبل حدوث الانهيار التام ثقافة الخلية. تعرض الخلايا أيضا إلى تلطيخ الفلورسنت وعرضها باستخدام متحد البؤر المجهري للتحقيق في النشاط الفيروسي على F-أكتين التعلق ونوى النزاهة. الاستنتاج من هذه الدراسة هو أن H. vitripennis خلايا قادرة على المستزرعة وتستخدم لانتاج كميات كبيرة من HoCV-01 على مستوى مناسب للسماح إنتاج المبيدات الحيوية.
Introduction
تم التعرف التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis في Germar 1821) باعتباره المسيطر من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، العامل المسبب للمرض بيرس من الكرمة (PD) في أمريكا الشمالية 1. إدارة السكان الحشرات سرعان ما أصبح محور البحوث لمكافحة هذه المشكلة المدمرة لصناعة زراعة الكروم في ولاية كاليفورنيا وعبر جنوب الولايات المتحدة. A-بالمعنى الإيجابي، واحد الذين تقطعت بهم السبل فيروس RNA عائلة Dicistroviridae، Homalodisca-01 فيروس تم التعرف coagulata (HoCV-01) في H. البرية السكان vitripennis وتبين أن زيادة معدل الوفيات في هؤلاء السكان 2-4، في حين خفض مقاومة الحشرات للمبيدات الحشرية.
تطوير أساليب فعالة إلى الخلف المصابة H. كانت vitripennis إلى مرحلة البلوغ في إعداد مختبر صعبا بسبب <eم> H. vitripennis لديها مختلف الاحتياجات الغذائية مراحل محددة تتطلب مجموعة متنوعة من النباتات المضيفة 5-8. ويلزم مرافق محددة لH. الحي الخلفي vitripennis في الولايات المتحدة؛ وبالتالي، ثقافة الخلية هي أكثر اقتصادا وبديلة قابلة للحياة، فضلا عن الحيوية على نحو متزايد لHoCV-01 كشف والتكرار 2،9. حين طرق أساسية لإنشاء مزارع الخلايا من H. يتم وصف vitripennis، ولم تستخدم هذه الأساليب للإنتاج التجاري من عوامل المكافحة البيولوجية، مثل الفيروسات 2.
الهدف العام المتمثل في الإجراءات التالية هو إنتاج نسبة عالية من HoCV-01 مناسبة للاستخدام كعامل المكافحة البيولوجية. يتطلب تكاثر الفيروس الخلية الحية، وهذا هو السبب زراعة بنجاح وتحسين H. الثقافات vitripennis أمر حيوي لتقدم مستويات إنتاج مربحة من الفيروس.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد يؤدي تزايد المخاوف بشأن تدفق الأنواع الغازية الزراعية إلى زيادة الطلب على منهجيات جديدة للدفاع ضد الآفات ومسببات الأمراض الناشئة. وتركز الوقاية من الأمراض وإدارة ينطوي إدارة ناقلات الممرض وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة. الاقتصاد تلعب دورا حيويا في قرار ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
