の伝播<em> Homalodisca coagulataウイルス01</em>経由<em> Homalodisca vitripennis</em>細胞培養
Summary
ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。
Abstract
ガラス状の翼狙撃兵（Homalodisca vitripennis）は米国南西部で発見、非常vagileと雑食昆虫です。これらの昆虫はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、ブドウのピアース病（PD）の病因である木部が制限された細菌の優勢なベクトルである。ピアース病は、経済的に有害である。したがって、H. vitripennisは、病原体管理戦略のターゲットとなっている。 Homalodiscaのcoagulataウイルス-01（HOCV-01）と同定dicistrovirusはHの死亡率の増加と関連していたvitripennis集団 。宿主細胞はHOCV-01の複製に必要とされるため、細胞培養は、ロジスティックや生物農薬生産のための経済的価値がある目標と複製のための均一な環境を提供します。 H.の大規模増殖のために本研究では、システムpを組織培養を介した細胞が開発されたvitripennisウイルス複製のメカニズムをroviding。 HOCV-01は、全身昆虫から抽出され、培養されたH.に接種したさまざまなレベルで細胞をvitripennis。培養培地は168時間、24時間毎に除去し、RNAを抽出し、定量RT-PCRで分析した。細胞は、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いて細胞生存性を定量化するために計数した。全ウイルス粒子は、全細胞培養崩壊が発生する前であると判断した時点であった、感染後96時間までの抽出された。細胞はまた、蛍光染色を施し、F-アクチンの取り付けおよび核完全性に対するウイルス活性を調査するために、共焦点顕微鏡を用いて観察した。この研究の結論は、Hである。 vitripennis細胞を培養し、バイオ農薬の生産を可能にするために適切なレベルでHOCV-01の大量生産のために使用されることが可能である。
Introduction
（Homalodisca vitripennisゲルマール1821）ガラス状の翼狙撃兵はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、北米1ブドウ（PD）のピアース病の原因因子の優勢なベクトルとして同定されている。昆虫個体群管理はすぐにカリフォルニアのブドウ栽培産業へと南部米国各地、この破壊的な問題に対処するための研究の焦点となっている。家族Dicistroviridae、Homalodisca coagulataのウイルス01（HOCV-01）に属するプラスセンス一本鎖RNAウイルスは、野生H.で同定されているvitripennis集団および殺虫剤に害虫の抵抗性を低下させながら、それらの集団2-4の死亡率を増加させることが示さ。
効果的にリアH.感染させる手法の開発実験室の設定で成体までvitripennisがあるため困難であった<eM> H。 vitripennisは宿主植物5-8さまざまなを必要とする別のステージ特異的な栄養ニーズを持っている。具体的な施設は、リアライブHに必要とされる米国ではvitripennis;そのため、細胞培養は、より経済的で実行可能な代替だけでなく、HOCV-01の検出およびレプリケーション2,9にとってますます不可欠です。 H.の細胞培養を確立するための基本的な方法は、一方vitripennisが記述され、これらの方法はまだ、このようなウイルス2のような生物的防除剤の商業生産のために利用されていない。
次の手順の全体的な目標は、生物的防除剤としての利用に適しHOCV-01を高濃度で製造することである。ウイルス複製がなぜ成功し、Hを栽培し、最適化された生細胞を必要とし、 vitripennis培養は、ウイルスの収益性の高いレベルを生成するの進展に不可欠です。
Protocol
Representative Results
Discussion
侵略的な農業の種の流入に関するライジング懸念は、新興害虫や病原体から身を守るための新たな方法論の需要増加につながりました。病気の予防と管理の焦点は、病原体のベクトルの管理を含み、この研究の主な対象となった。経済性、実用的なアプリケーションは、大面積にわたって、低コスト12に大量である必要があるため、農業において、病原ベクトルを管理するためのバイ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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