루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정
Summary
This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Abstract
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Introduction
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 루시퍼 라제 기반 접근 용이성, 신속, 최소 장비 필요성, 및 비교적 낮은 비용을 포함하는 다른 기존의 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 이 키에 기여 시리얼 희석 단계의 회피이다. 그럼에도 불구하고,이 용액을 희석 프로토콜 기반 유도체 확실히 가능하며, 최근 높은 처리량 바이러스 화면 (11)에 루시 페라 제 발현 에볼라 역가를 평가하는데 사용 하였다. 본질적으로 더 많은 시간이 소요되고 비용이 더 필요한 경우이지만, 이러한 적응 바이러스 정량 큰 동적 범위를 제공 할 수있다. 높은 처리량 스크린의 문맥에서의 바이러스 역가를 평가하기에 특히 적합 할뿐만 아니라, 우리 원스텝 루시페라아제 기반 바이러스 정량화 방법은 바이러스 복제의 경우의 감염성 비리 온의 정확한 추정치를 생성한다. 또한, 동일한 실험에서 세포 독성 데이터와 함께 발광의 판독은 더 줄표적 세포에 대한 실험 조건의 효과의 완전한 그림은, 온 콜리 틱 바이러스 및 약물 스크린의 맥락에서 특히 유용하다.
여기에 도시 된 예는 하나의 복제 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 사용한다; 그러나이 프로토콜은 프로토콜 약간 작은 조정과 바이러스를 복제 및 비 복제 수에 적응 될 수있다. 이는 우두, HSV와 AAV (그림 5 참조)와 같은 DNA 바이러스를 포함한다. 예컨대 백시 니아 바이러스와 같은 세포 내 바이러스 감염 샘플, 종래 정량 (예를 들면, 적어도 하나의 동결 – 해동주기)에 바이러스 분리 단계를 필요로한다. 다른 바이러스에이 기술을 적용하면, 루미 의해 번호판의 판독에 바이러스 상등액 또는 파쇄물의 전송에서 배양 시간을 최적화 할 필요가있다. 이 파라미터는 허용 세포주에서 바이러스의 복제주기 및 P의 강도에 주로 의존 할 것이다romoter 루시 페라 제 발현을 운전. 이것은 가장 최적화 단계에서 완전한 표준 곡선을 사용하여 수행된다. 이를 위해, 하나의 제조 표준 곡선의 여러 복제물을 가진 적절한 허용 세포주를 감염 후의 전사 포인트 각각은 서로 다른 시간에 복제 읽어야한다. 이상적으로, 배양 시간 점은 예상되는 시료 역가 범위에 걸친 LOG (RLU) 및 LOG (역가) 사이의 선형 관계로 연결이 선택된다. VSVΔ51-Fluc의 경우,이는 전형적으로 10 4 PFU / ㎖ -10 7 PFU / ㎖ 5 시간의 배양 시간에 대한. 낮거나 높은 역가가 샘플로부터 예상되는 경우, 하나는 단순히 증가 또는 각각 배양 시간을 줄일 수있다. 대안 적으로, 샘플을 ELISA에 대해 통상적으로 수행되는 많은 범위로 희석 될 수있다.
전술 한 바와 같이,이 방법은 물론 대부분의 단계가 자동화 될 수있는 약물 라이브러리를 이용하여 높은 처리량 약물 스크린을 수행하기에 적합하다. 세포는 전자 도금 할 수 있습니다fficiently 자동화 마이크로 디스펜서를 사용하여, 약물 라이브러리는 96 – 채널 액체 핸들러를 사용하여 첨가 할 수 있으며,이 바이러스는 마이크로 디스펜서를 사용하여 추가 될 수 있고, 플레이트는 자동화 루미로 읽을. 이론적으로,이도 384도 이하의 포맷으로 구성 될 수있다; 그러나이 마지막에 제한은 도금 될 수있는 셀의 수, 주어진 적은 세포 (역가) 관계를 로그에 LOG (RLU)의 선형성에 좁은 범위에 이르게됩니다. 마지막으로, 또는 다른 레사 주린 염료를 사용하여 대사 세포 생존 능력의 평가를 쉽게 바이러스 12과 함께 상승적 바이러스 사멸로 이어질 스크린 또는 화합물의 식별에서 세포 독성 화합물의 차별을 허용 흐름에 혼입 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법의 한계는 항상 가능한 것은 아니다 루시퍼 라제 유전자 발현하는 바이러스의 요구 사항, 및 충분히 허용 세포주의 이용을 포함한다. 그러나, 적응 가능한 가능성다른 리포터 유전자와 함께 사용하기위한 방법 (예를 들면, GFP)는 리포터 정량화 방법 잡음비 적당한 선형성 및 신호가 제공. 전반적으로 기재된 하이 스루풋 방법은 다양한 바이러스에 맞도록 수정 및 다양한 애플리케이션에 맞추어 질 수있다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J. Uses of flow cytometry in virology. Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
