ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

1試料の調製 96ウェルプレートに滴定し、転送のためのルシフェラーゼを発現するウイルス（例としてここにVSVΔ51-Flucを）を含むサンプルを得る。あるいは、直接に96 – ウェル組織培養プレートおよび使用上清中の感染を行う。 標準曲線を含めるために、未処理の2つの列を残します。 96ウェルプレート中で直接行われた実験のために、後日、-80℃及び力価における実験（40時間後に感染症）またはストアの終わりに力価。 ウイルス力価測定のための許容細胞の調製滴定前の24時間は、2.5×10 5〜10％ウシ胎児血清（FBS）、30mMのHEPESを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中の細胞/ mlおよび1％ペニシリン/の濃度でVero細胞の懸濁液を調製ストレプトマイシン。注：このプロトコルは、Vero細胞を用いたが、VSV感染のための任意の適切な許容細胞系は、bの可能性eが使用。 マイクロプレートディスペンサーを用いて、96ウェル白色固体平底プレートに2.5×10 4個の細胞（100μl）をシード。 プライミングのためにプレートあたりの細胞懸濁液12ミリリットルを加えた5ミリリットルを用意します。 滅菌水50mlでチューブをフラッシュすることでクリーンマイクロプレートディスペンサーカセット。 細胞懸濁液をマイクロディスペンサ線を記入し、細胞懸濁液5mlを介して流す。 白壁の96ウェルプレートの各ウェルに100μLを分注するプログラムを選択します。分注、および追加のプレートについて、必要に応じて繰り返します。不透明な底の白壁プレートは細胞の健康と密度の検証に使用されている場合にも96ウェル透明平底プレートにいくつかのウェルをシード。 元の容器に終了し、フラッシュセル。チューブを通して暖かいの滅菌水50ml、続いて70％エタノール50ミリリットルを実行して、カセットを清掃してください。 カセットとチューブは、pであることを確認してくださいpropriately使用の間に掃除した。 加湿した5％CO 2インキュベーター中で37℃で24時間細胞をインキュベートします。 ウイルス標準曲線の調製 10 8 pfu / mlで、10 7 pfu / mlでの、：無血清DMEM中でVSVΔ51-Fluc細胞の標準曲線を作成など、次のようにベロ細胞上への転写後に、1ml当たりのプラーク形成単位（pfu）の最終濃度になる10 6 pfu / mlで、10 5 pfu / mlで、10 4 pfu / mlで、10 3 pfu / mlで、10 2 pfu / mlで、および10 1 pfu / mlで。 Vero細胞のプレートあたり各濃度の50μlを加えた余分な10％を準備します。 注：ルシフェラーゼウイルスストックの力価は、絶対定量を可能にする標準曲線を生成するために、古典的な方法10で評価する必要があります。さもなければ相対定量は、任意に基づいて、ウイルス力価を設定することにより、正確な力価情報なしで達成することができる希釈工程上。例えば、標準曲線の最初の希釈は、のように、10 7、10 8ウイルス性単位及び以下の10分の1の希釈に設定してもよい。絶対的定量は正確ではないので、この文脈では、一方が予め定められたサンプルと比較した倍数変化として値を表すべきである。 許容細胞へのサンプルの上清の4譲渡単層が少なくとも95％コンフルエントであることを確認する光学顕微鏡下で透明底の96ウェルプレートに播いたベロ細胞を確認する。 白壁プレートに播種し、Vero細胞上にサンプル上清25μlを転送します。標準曲線のために指定2列に上清を転送しないでください。注：これは96チャンネルの液体ハンドラーを使用して、単一のプレート上の全てのウェルについて同時に行うことができる。 8または12チャンネルマルチチャンネルピペッターを使用して、中のVero細胞に、ステップ3で作成した標準曲線の各希釈液25μlを追加2指定された列。 RTで430×gで5分間遠心プレート。 加湿した5％CO 2インキュベーター中、37℃で5時間インキュベートする。 細胞生存の5評価注：透明な96ウェルプレートで行っ感染実験から得られた上清から開始する場合、サンプルの生存率は、レサズリンとして細胞生存率指標色素で定量する前に評価することができる。 ウイルスおよび細胞を含有する試料の96ウェルプレートの各ウェル中の体積の10％に等しい量のレザズリン加える。セルは専用それぞれ、100％および0％の生存率の値を決定するために、メディアのみの対照と同様に制御して組み込みます。 2-4時間（細胞の種類および色素の商業的に入手可能であるか、または再構成された粉末の濃度に依存して変化するインキュベーション時間）の後、読み取り、蛍光プレートリーダー（530〜560nm励起、590発光）を用いて信号を記録する。レポートセルviabili×100％式相対代謝活性=（ – – ネガティブコントロール信号）/（細胞のみ信号を制御する負の制御信号）を（試験サンプル信号）による試料のためのティルシフェリン基質の6。準備 30分で5時間のインキュベーションの終了前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で2 mg / mlの溶液を得たルシフェリンを準備。プレート当たり2.5ミリリットルを加え、余分な2ミリリットルを準備します。光からソリューションを保護します。 NOTE：ルシフェリンはまた、以前の日に調製し、使用するまで4℃で保存することができる。 7。読書生物発光 5時間のインキュベーション期間の後、白色固体プレート中のVero細胞の各ウェルに、25μlのルシフェリンを加える。手動で、またはルミノメーターに統合自動化されたディスペンサーでルシフェリンを追加します。注：単一およびエンドポイントを持つ機器の使用は、ルシフェラーゼ互換溶解BUFの添加を必要とすることが読み取るFERの一貫性を改善するためにルシフェリン基質を添加する前に。 次のパラメータを使用してプレートをお読みください。 5秒間振る。 30秒待ちます。 適切な固定感度/露出値での発光をお読みください。オプションは、機器上で利用可能である場合には、マルチポイントの精度を向上させるために（ 例えば、3×3の行列）を読み取る使用しています。 定量化された生物発光強度を記録し、保存します。 自動化されたディスペンサーは、ルシフェリンを追加するために使用された場合は、ルシフェリン、プライム暖かい滅菌水でラインをパージする。 8。データ解析正確な結果を得るために、標準曲線のヒルの方程式を生成するために、非線形回帰を解く。ウイルスの発現ユニットを算出するために力価測定サンプルにこの式を適用します。一部のウイルスや状況は、直線的な関係を持つ標準曲線を生成することができる。この場合の一次方程式を解く。