כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע
Summary
This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Abstract
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Introduction
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגישה מבוססת לוציפראז המתואר כאן מספקת מספר היתרונות על פני שיטות קיימות אחרות, כוללים קלות, זריזות, צורך ציוד מינימאלי, ועלות נמוכה יחסית. גורם עיקרי בזה הוא ההימנעות מצעד דילול סדרתי. יחד עם זאת, נגזרים מבוססי דילול סדרתי של פרוטוקול זה בהחלט אפשריים והיו בשימוש לאחרונה להעריך titers אבולה להביע לוציפראז במסך אנטי תפוקה גבוהה 11. בעוד מטבעו זמן רב יותר ויקר יותר, עיבודים כזה עשויים לספק טווח דינמי גדול יותר לכימות נגיפית בעת צורך. בנוסף להיות גם מתאים במיוחד להערכת titers ויראלי בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה, השיטה הנגיפית הכימות מבוסס לוציפראז צעד אחד שלנו יוצרת הערכות מדויקות של virions זיהומיות במקרה של שכפול וירוסים. יתר על כן, מונה המציין הארה, יחד עם נתונים רעילים מאותו הניסוי לתת יותרתמונה של ההשפעה של תנאי ניסוי על תאי יעד מלא, וזה שימושי במיוחד בהקשר של וירוסי oncolytic ומסכי סמים.
הדוגמא מאוירת כאן משתמשת וירוס RNA משכפלים שלילי גדיל בודד; עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למספר משכפלים ולא משכפלים את וירוסים עם כמה התאמות פרוטוקול קטין. זה כולל וירוסי DNA כגון Vaccinia, HSV, וAAV (ראה איור 5). דגימות נגועות בוירוסים תאיים, כגון וירוס Vaccinia למשל, דורשות צעד שחרור וירוס לפני כימות (למשל, מחזור ההפשרה הקפאה לפחות אחד). כאשר מיישם את הטכניקה הזאת לוירוסים אחרים, יש צורך לייעל את זמן דגירה מהעברת supernatant או lysate הנגיפיים לקריאה של הצלחות על ידי luminometer. פרמטר זה יהיה תלוי בעיקר במחזור השכפול של הנגיף בתא הקו מתירני ואת כוחו של עמ 'romoter נהיגה ביטוי בלוציפראז. זה נעשה הכי טוב על ידי שימוש בעקומה סטנדרטית המלאה בצעד אופטימיזציה. כדי לעשות זאת, יש להדביק את שורת התאים מתירנית המתאימה עם משכפל שונים של העקומה סטנדרטית מוכנה ולקרוא כל לשכפל בכל פעם שונה מצביע הודעה העברה. באופן אידיאלי, נקודת זמן דגירה נבחרה שמובילה לקשר לינארי בין LOG (RLU) וLOG (כייל) פורש מגוון כייל המדגם הצפוי. לVSVΔ51-Fluc, זה בדרך כלל מ10 4 pfu / מ"ל -10 7 pfu / מ"ל לזמן דגירה 5 שעות. אם titers נמוך יותר או גבוה יותר צפויים מדגימות, אפשר פשוט להגדיל או להקטין את זמן הדגירה בהתאמה. לחלופין, דגימות עשויות להיות מדוללים ליפול בטווח הרבה כפי שנעשה בדרך כלל עבור ELISA.
כפי שצוין לעיל, שיטה זו מתאימה גם לביצוע מסכי תרופת תפוקה גבוהה באמצעות ספריות סמים כמו רוב הצעדים יכולים להיות אוטומטיים. יכולים להיות מצופים תאים דוארfficiently באמצעות מתקן microplate אוטומטי, ספריית התרופה ניתן להוסיף באמצעות מטפל נוזלי 96 ערוצים, ניתן להוסיף וירוס באמצעות מתקן microplate וצלחות לקרוא באמצעות luminometer אוטומטי. בתאוריה, זה יכול גם להיות מותאם ל384 גם או פורמטים קטנים יותר; עם זאת, ההגבלה לשם כך הוא מספר התאים שיכולים להיות מצופה, תאים פחות נתונה מובילה למגוון צר יותר בליניאריות של LOG (RLU) לLOG מערכת יחסים (כייל). לבסוף, הערכה של כדאיות תא באמצעות resazurin או צבעים מטבולים אחרים ניתן לשלב בקלות בזרימת העבודה, המאפשר לאפליה של תרכובות רעילות לתאים במסכים אנטי או זיהוי של תרכובות שהובילו להרג סינרגיסטי בשילוב עם וירוסים 12. עם זאת, מגבלות של שיטה זו כוללות את הדרישה של וירוס transgene להביע לוציפראז, וזה לא תמיד אפשרי, ואת הזמינות של שורת תאים מספיק מתירנית. עם זאת, סביר להניח ניתן להתאיםהשיטה לשימוש עם גני כתב אחרים (למשל, GFP) בתנאים שיש שיטת כימות כתב ליניאריות מתאימה ויחס אות לרעש. בסך הכל, שיטת התפוקה גבוהה שתוארה יכולה להיות שונה כדי להתאים לוירוסים רבים ושונים ומותאם ליישומים מגוונים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J. Uses of flow cytometry in virology. Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
