Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы
Summary
This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Abstract
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Introduction
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подход люциферазы основе описано здесь предоставляет ряд преимуществ по сравнению с другими существующими методами в том числе ее простота, быстрота, минимальной потребности оборудования и относительно низкой стоимости. Ключевой вклад в это избегание последовательный стадии разбавления. Тем не менее, последовательные разбавления основе производные этого протокола, безусловно, возможно и недавно были использованы для оценки люциферазы экспрессирующих Эбола титры на экране противовирусной высокой пропускной 11. В то время как по своей природе более трудоемким и более дорогим, такие адаптации может обеспечить более широкий динамический диапазон для количественного определения вирусной когда это необходимо. В дополнение к тому, особенно хорошо подходит для оценки вирусные титры в контексте экранов высокой пропускной, наш один шаг люциферазы на основе вирусной способе количественного генерирует точные оценки инфекционных вирионов в случае репликации вирусов. Кроме того, показания люминесценции наряду с цитотоксичности данных из того же эксперимента дают болееполное представление о влиянии экспериментальных условиях на клетках-мишенях, что особенно полезно в контексте онколитических вирусов и экранов наркотиков.
В приведенном примере проиллюстрировано использует тиражирование негативное РНК вируса одножильному; Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован к ряду репликации и не репликации вирусов с несколькими небольшими изменениями протокола. Это включает в себя ДНК вирусов, таких как Vaccinia, HSV, и AAV (рисунок 5). Образцы инфицированных внутриклеточных вирусов, таких как вирус коровьей оспы, например, требует стадии вирус высвобождением перед количественной (например, по меньшей мере, один замораживания-оттаивания). При применении этого метода с другими вирусами, необходимо, чтобы оптимизировать время инкубации от передачи вирусного лизата или надосадочной жидкости к чтению пластин с помощью фотометра. Этот параметр будет зависеть главным образом от цикла репликации вируса в разрешительной клеточной линии и прочности рromoter вождения люциферазы выражение. Лучше всего это делать с помощью полного стандартную кривую на этапе оптимизации. Чтобы сделать это, нужно заразить соответствующий разрешительный клеточной линии с различными повторах подготовленного стандартной кривой и читать друг повторить в другое время указывает После передачи. В идеале, время инкубации точка выбирается, что приводит к линейной зависимости между LOG (RLU) и LOG (титр), охватывающих ожидаемый диапазон образец титра. Для VSVΔ51-Fluc, это, как правило, от 10 4 БОЕ / мл -10 7 КОЕ / мл в течение 5 ч времени инкубации. Если низкие или более высокие титры, как ожидается, из образцов, можно просто увеличить или уменьшить время инкубации соответственно. С другой стороны, образцы могут быть разбавлены, чтобы находиться в пределах, насколько это сделано, как правило, для ELISA.
Как упоминалось выше, этот способ хорошо подходит для выполнения высокой пропускной экраны наркотиков с использованием библиотеки наркотиков, как большинство шагов может быть автоматизирована. Клетки могут быть покрыты еfficiently использованием автоматического Диспенсер для микропланшет, библиотека препарат может быть добавлена с помощью обработчика жидкости 96-канальный, вирус может быть добавлена с помощью микропланшет дозатор и пластины читать с помощью автоматизированной люминометра. В теории, это также может быть адаптирован к 384-луночный или меньших форматах; Однако, ограничение в этом направлении является количество клеток, которые могут быть покрыты, приведенные меньше клетки приводит к более узком диапазоне в линейности LOG (РОС) в LOG (титр) отношения. Наконец, оценки жизнеспособности клеток с использованием резазурин или другие метаболические красители могут быть легко включены в рабочий процесс, позволяя дискриминации цитотоксических соединений в противовирусных экранов или идентификации соединений, которые приводят к синергетическому убийства в сочетании с вирусами 12. Тем не менее, ограничения этого метода включают требование люциферазы трансген, выражающей вируса, что не всегда возможно, и наличие достаточно разрешительной клеточной линии. Тем не менее, вполне вероятно, можно адаптироватьСпособ для использования с другими репортерных генов (например, GFP), при условии, что метод репортер количественное имеет подходящую линейность и отношение сигнал-шум. В общем, описанный способ с высокой пропускной способностью может быть изменен, чтобы удовлетворить различные вирусы и с учетом разнообразных применений.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J. Uses of flow cytometry in virology. Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
