Gastropod Molluskların Yumurta döflenmesi erkek Aksesuar Bezi Ürünlerinin Etkisi

1.. Yetiştirme Tesisi VU Üniversitesi gibi bir laboratuvar kültür Lymnaea stagnalis (L.) erişkin örnekleri elde. Sürekli su değişimi var damızlık tesisi (molluscarium) ve deneysel tanklarda, hem de 20 ° C'de düşük bakır su koruyun. 12 saat: 12 saatte aydınlık / karanlık döngüsünü ayarlayın. Damızlık, yetişkin salyangoz pestisit içermeyen marul libitumdan beslemek TetraPhyll (Balık) gevreği ile genç gençlere beslemek. 24 saatlik zaman dilimi içinde serilir yumurta kitlelerden başlayarak, yaşlarına göre ayrı tanklarda salyangoz koruyun. Salyangoz onlar etkileri önlemek için, iade edilir üreme tanklarından çıkarıldıktan sonra, hafifçe farklı koşullar altında hem de pseudoreplication önlemek için muhafaza edilerek. 2. Diseksiyon 1 hafta salyangoz izole ve tha sağlamak için, ad libitum beslemekt onlar tam sperm ve seminal sıvı mağaza var. Bir stereo mikroskop, iğneli bir diseksiyon plaka, küçük bir cerrahi makas, kaba ve ince forseps, 50 mM MgCl2 çözeltisi, enjeksiyon iğneleri (0.3 mm x 13 mm) ve bir kağıt havlu ile doldurulmuş bir 10 ml şırınga hazırlayın. MgCl (31.6 ± 2.1 mm ve ıslak ağırlığı 0.55 g ± 2.89 arasında bir kabuk uzunluğu ile erişkin salyangoz genelde 3 ml veya daha fazla) 2 solüsyonu enjekte tarafından bir salyangoz Euthanize. 45 ° açıyla enjeksiyon iğnesi ile ayak nüfuz ve salyangoz rahatlatır ve (saniyeler içinde) uzatılmış kalana kadar yavaşça sürekli basınç uygulanarak enjekte. Enjeksiyon iğnesi çıkarın ve salyangoz (tentacle geri çekilme refleksi yoktur olup olmadığını kontrol ederek, örneğin) ötenazi olup olmadığını kontrol edin. Dikkatle kaba forseps kullanarak kendi eğrilik aşağıdaki kabuk kaldırmak. Yarım, hafifçe forseps ile kazıyarak kabuğundan columellar kas ayırmak. Yavaşça t bükümo kabuğun sarma yönünü takip, kabuğundan dışarı salyangoz. Diseksiyon plaka üzerinde salyangoz yerleştirin ve ayağın arka ucunu aşağı pin. Sonra, kafasına bir iğne yerleştirin ve diseksiyonu kolaylaştırmak için salyangoz bazı gerginlik koydu. Daha sonra diseksiyon için bir referans noktası olacaktır kadın gonopore, lokalize. Cerrahi makas ve ince forseps kullanarak, sadece manto kenarı altında, ilk kesi yapmak ve kadın gonopore doğru kesti. Makas 'kanatlarının biri beden duvarının altında itildiğinde, sadece vücut duvarı ve iç organların hiçbiri, kesilmiş olduğundan emin olmak için hafifçe yukarı kaldırın. Kafasına doğru gonopore yukarıdaki kesme devam edin ve düz bir çizgide kesti. Prostat bezi (posterior) ve seminal (anterior) yerelleştirilmesine. Bunları dikkatle incelemek ve buz üzerinde saklayın. Seminal sıvı ve / veya sperm içeren test çözümler yapmak için bu kullanın. Fizyolojik Lymnaea sal kullanınine (5.83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3.76 mmol / L MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37.53 mmol / L KCl) bir taşıyıcı ortam olarak. Prostat bezinin lümeni hem de seminal veziküller gelen sperm mevcut olan meni toplayın. Daha sonra, yavaşça onların içeriğini ifade ve bir forseps ile organ dokusuna kaldırarak ayrı şişelerde tuzlu hem de askıya. Buz üzerinde tutmak ve aynı gün kullanın. Daha sonra, farklı tedavi çözümleri oluşturmak için bu süspansiyonlar karıştırın. 3.. İntravajinal Enjeksiyon Vajina içi enjeksiyon işlemi başlamadan önce, (kabuğun uç uyacak şekilde yapılmış) bir silikon kabuk kalıp hazırlanması, 1 mm şırınga, 1 mm bir çapa sahip, 10-12 cm silikon boru, (enjeksiyon iğneleri köreltilmiş 0.3 mm x 13 mm ), iri forseps ve keskin bir enjeksiyon iğnesi ile donatılmış bir 50 mM MgCl2 çözeltisi ile doldurulmuş 10 ml aynı şırınga. Bazı tedavilerde seminal sıvı (ya da bireysel seminal sıvı proteinler) eklemek için gerekli sperm, toplayın; Bir biyolojik olarak uygun bir doz bir prostat ve seminal vezikül enjeksiyon başına arasında 1/3 eşittir. NOT: temsilcisi sonuç bölümünde (Şekil 1) üç farklı tedaviler ile deney sonuçları gösterilmiştir: Kontrol yalnız (taşıyıcı ortam, yani tuzlu su), Ovipostatin (tespit seminal sıvı proteinlerden biri) ve Ovipostatin sperm ile eşlik etti. Buna ek olarak, diğer türlerdeki biyolojik olarak uygun doz tahmin etmek için, son şeklindeki 16 ve cinsel yolla izole kalmış kişiler kişilerin prostat bezinin ağırlık farkı ifade eder. Hazırlanan test çözeltileri her biri için 1 ml şırınga hazırlayın. Tek çözümü ile her şırınga doldurun ve içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Her şırınga Köreldiğini enjeksiyon iğnesi takın. Enjeksiyonu 1 kullanın10 sm bir minimum uzunluğa sahip mm çaplı silikon tüp. Dikkatle tüpü delmek için değil emin olun, enjeksiyon iğnesi üzerinde silikon tüp kaydırın ve yavaşça şırınga basınç uygulayarak tüpten havayı çıkarın. Noktası 2.3 ile aynı protokolü izleyerek bir salyangoz uyuşturan. Bu kez 50 mM MgCl2 fazla 2-3 ml enjekte etmek değil emin olun. Sabit bir pozisyonda tutmak için kabuk-kalıba salyangoz yatıyordu. (Bu konum aynı zamanda tatlı su salyangoz diğer türler için de geçerlidir) açıkça doğru tentacle ve erkek gonopore için hayvan, anterior sağ tarafında beyaz bir nokta olarak görülebilir kadın gonopore, bulun. Engelsiz erişim için emin olun. Silikon tüpün ucunu tutun ve yavaşça dişi gonopore içine silikon tüp yaklaşık 2-4 mm eklemek için bir forseps kullanın. Dikkatlice şırıngayla basınç uygulanır ve test çözeltisi 0.03 ml enjekte edilir. Yarım dakika bekleyinTüpü çıkarmadan önce dişi yolu içine yaymak için boru içindeki basıncın izin vermek için katkı sağlayacaktır. O izlenebilir onun izolasyon, kapsayıcı, işlenmiş salyangoz dönün ve deneysel tankında sedasyon kurtarmak için izin verir. 4. Biyoassay Tanımlama için her salyangoz Etiket ve kabuk uzunluğu ölçer. İkincisi üreme çıktı hesaplarken alakalı boyutu, iyi bir göstergedir. Deney tankı içinde su değişimi sağlamak için delikli bir 460 ml kap içinde her bir salyangoz izole edin. Bu, etkili bir su değişimi sağlamak için, suyun akış yönünde delikleri olan, doğru yönde kapları yerleştirmek önemlidir. Biyoassay sırasında, marul standart bir miktarda düzenli salyangoz beslemek. Marul kesmek için yuvarlak, metal zımba kullanın. Bu protokolde 19.6 cm 2 marul diskleri a yaklaştığı, kullanılanonlar en fazla bir gün yiyebilirsiniz montaj. Bir spatula düz tarafı kullanarak bir yumurta kitle toplamak ve konteyner duvardan yumurta kütlesi kazıyın. Yumurta kitle toplamak için kaşık tarafını kullanın. NOT: Sadece atılmıştır Opak yumurta kitleler (onlar döşeme sonra birkaç saat içinde saydam hale) Tarama için kullanılan olamaz. Onlar haftada 2-3 yumurta kitleleri üretmek için bu protokolü modeli türler için, Lymnaea stagnalis, her gün yumurta kitleler için kontrol edin. Bu, diğer türlerinde farklılık gösterebilir. Tarayıcı sürücüsünü içeren bir (dizüstü) bilgisayar, bir düz yatak tarayıcı, standart bir milimetre ölçek, bir spatula, tabak ve cam karoları kullanarak, dijital toplanan yumurta kitleleri tarayın. Transfer plakaları her yumurta kitle yerleştirin ve plakaları tam kadar tekrarlayın. Daha sonra, yumurta kitleler kağıt havlu üzerinde hafifçe dokunmak kurutmak ve aktarma kalıplarda olduğu gibi aynı sırada cam karo üzerine aktarın. (Baş aşağı her karo çevirinyumurta kitleler cam karo sopa) ve dikkatle sadece milimetre ölçeği altında, flatbed tarayıcıya yerleştirin olacaktır. Hepsi aynı odak düzlemi içinde görünür böylece eşit yumurta dağıtacak olan yumurta kitleleri düzleştirmek için basınç biraz uygulayın. Tüm yumurtalar eşit basık olduğunu sağlamak için iki kenarlarında bir bant standart miktarda karoları Fit. Tarayıcı ayarlarını ayarlayın. Bu, onun maksimum çözünürlüğü ayarlamak bir önizleme taraması yapmak, çalışma alanı kırpma ve parlaklık ve kontrastı ayarlamak için önemlidir. Yumurta kitleleri tarayın. Daha da geliştirilmesi ve kuluçka için kendi etiketli 20 ml bir cam şişe içinde, her yumurta kitle yerleştirin. Düzgün oksijenli tutmak için her gün şişeleri kuluçka suyu yenileyin. Aşağıdaki sırayla yavru sayı ve büyüklüğüne göre bu yapın: (hayır yavru) dökülen / boşaltılarak (kuluçka başlangıcını) taşan ve bir pipet (birçok yavru) ile suyu dışarı çıkarmak. <p class = "jove_title"> 5. Yumurta Ölçme ve Sayma Özgürce kullanılabilir görüntü analiz yazılımı ImageJ (NIH, ABD) ve hücre sayaç eklentisini yükleyin. Açık ImageJ yanı sıra veri aktarmak için bir elektronik tablo programı. Sonra ImageJ yumurta kitlelerin taranmış bir resim açın. Milimetre ölçeğine gitmek için zoom aracını kullanarak ölçeği ayarlayın. Yakınlaştırmak ve ekranı doldurmak için 1 mm penceresini ayarlamak. 1 mm belirtmek iki çizgi arasındaki satırı aracını kullanarak bir çizgi çizin. Analiz gidin ve ölçeğini ayarlayın. Açılır menüde ölçülen uzunluk seçeneği 1 olarak bilinen mesafeyi ayarlamak ve uzunluk birimi mm, görünür hale gelir. Kutu Küresel kontrol edin ve pencereyi kapatın. Analiz gezinme tarafından tercih edilen ölçümler (uzunluk, genişlik, çevresi) ayarlayın ve Alan ve Feret Çapı (uzunluk ve genişlik) seçerek Ölçümleri ayarlayın. Onaylamak ve görüntü analizleri ile devam etmek için Tamam'a tıklayın. Yumurta ölçmek için, zoölçülmesi gerekiyor ilk yumurta kütlesinin bir yumurta üzerinde om. % 800 bir zoom tavsiye edilir. Ardından, eliptik alet tam yumurta, ctrl etrafında bir oval çizin kullanarak + D (iki kez aynı yumurta ölçme önlemek için) görüntü üzerinde çevresini çizin. Sonra oval (uzunluk, genişlik, çevresi) özelliklerinin ölçümünü kaydetmek için ctrl + M tuşuna basın; Bir pop-up ekran ölçümlerini görüntüleyerek açılır. NOT: yumurta ölçmek için eliptik araç kullanımı tüm türler için geçerli değildir. Homojen olmayan şekilli yumurta olan türler için, bunun yerine serbest seçimleri kullanın. Gerektiği kadar çok yumurta ölçün ve sonra. Xls çalışma sayfası olarak tedbirleri kaydedin. İsteğe bağlı olarak, doğrudan bir çalışma sayfasına verileri kopyalamak. Daha sonra sayaç penceresini kullanarak, bir yumurta kitle içinde yumurta sayısı ve manuel çalışma içine sayıları koydu. Alternatif olarak, hücre sayacı plug-in yardımı ile yumurta kütlesi başına birey yumurtaları saymak. Bunun için, Plug-ins gidinDaha sonra, analiz ve Hücre sayacı seçin. Hücre sayacı penceresi 'başlatmak' kutusunu ve basın 'orijinal tutmak' kontrol açılır. Yeni bir sayaç penceresi araç çubuğundan crosshair aracını seçin ve hücre sayacı menüsünde bir sayaç türü seçin, görünür. Hücre sayacı penceresinde tek yumurta tıklayarak tek tek yumurtaları saymak. Hücre sayacı menüsünden sayaç türünün yanındaki toplam sayısını dikkate alınız. Bir e-tabloya elle bu numarayı kopyalamak veya Sonuçlar basarak sonuç elde. Gerekirse, sayaç türleri ekleyerek tek sayma olay içinde birden fazla yumurta kitleleri saymak.