تأثير الغدة ذكر ملحق المنتجات على وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات
Summary
This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.
Abstract
في تسميد داخليا الحيوانات، وعادة ما أضيف السائل المنوي إلى الحيوانات المنوية، وتشكيل معا المني أو السائل المنوي. إلى جانب الحيوانات المنوية مغذية وتفعيل، يمكن للمكونات في السائل المنوي تؤثر أيضا على علم وظائف الأعضاء الإناث لزيادة نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية المانحة. في حين أفادت العديد من الدراسات هذه الآثار في الأنواع مع الجنسين منفصلة، وقد تناولت دراسات قليلة في هذا خنثوي الحيوانات في وقت واحد. ويعرض هذا البروتوكول الفيديو وسيلة لدراسة آثار السائل المنوي في الرخويات، وذلك باستخدام المياه العذبة الحلزون خنثوي في وقت واحد، والبركة الحلزون كبيرة المنقعية الراكدة، والنموذج الحي. في حين يظهر الإجراء باستخدام كاملة البروستاتا مقتطفات الغدة، والمكونات الفردية (أي البروتينات والببتيدات، ومركبات أخرى) من السائل المنوي يمكن اختبارها في نفس الطريق. آثار استلام مكونات السائل المنوي على وضع البيض يمكن قياسها كميا من حيث تواتر وضع البيض وتقديرات أكثر دقة من الأداء التناسلي للأنثى مثل أرقام بيضة داخل بيضة كل الجماهير. تظهر النتائج أن بروتينات السائل المنوي تؤثر على الانتاج التناسلي للأنثى في هذه خنثى في وقت واحد، وتسليط الضوء على أهميتها لاختيار الجنسي.
Introduction
عند نقله، وعادة ما يرافق الحيوانات المنوية عن طريق السائل المنوي التي تنتجها الغدد التبعي الذكور. في حين لعب بعض مكونات السائل المنوي الأدوار في تغذية الحيوانات المنوية وتفعيل 1، والبعض الآخر تؤثر فسيولوجيا الإناث من أجل زيادة نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية المانحة 2-4. ويتم اختيار هذه الآثار وخاصة بالنسبة لل، عن طريق الانتقاء الجنسي، عندما الأنواع غير منحل للغاية ولديه تخزين الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية كفاءة الهضم. في ظل هذه الظروف، تتنافس الجهات المانحة الحيوانات المنوية بشكل كبير للإخصاب البيض 5. في حين أن هناك أدلة وفيرة علائقية لأهمية المواد السائل المنوي للنجاح الإخصاب الذكور، دليل مباشر هو أكثر نادرة ولقد يفتش دراسات قليلة في تفاصيل التغيير الفسيولوجية و / أو المواد المعنية 6.
في الأنواع ذات الجنسين منفصلة (أي الذكور والإناث؛ gonochorists) هناك عدد قليل من التحقيق جيدا نموذج SPECIوفاق عندما يتعلق الأمر تكوين السائل المنوي وآثارها. وتشمل الأمثلة على ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن 6، والبعوض والملاريا، والأنوفيلة الغامبية 7، وخنفساء الدقيق الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم 8. مثل هذه الدراسات السائل المنوي هي أكثر ندرة بكثير عندما يتعلق الأمر الأنواع التي هي خنثوي في وقت واحد (أي الأفراد وظيفيا الذكور والإناث في نفس الوقت)، على الرغم من هذا النمط من الاستنساخ هو شائع في جميع أنحاء المملكة الحيوانية 9. المثال خنثوي أبرز نقل مادة الغدة التبعي هو على الارجح اطلاق النار ما يسمى الحب والسهام في القواقع الأرض 2،10، حيث يتم نقل المادة من قبل الجهة المانحة عن طريق الحقن تحت الجلد الحيوانات المنوية 11،12، أي لا جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية. ولكن هناك العديد من المنحرفين المتزامنة التي نقل المنتجات التبعي الغدة الذكور جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية، ومثل الأنواع النموذج المستخدم هنا، والبركة العظيمة الحلزون المنقعية الراكدة. وقد أظهرت أبحاث سابقة بالفعل أن تلقي السائل المنوي يؤثر على الانتاج التناسلي للأنثى من هذا النوع 13-15، ولقد تم تحديد العديد من البروتينات تشارك السائل المنوي 16،17.
الهدف العام من هذا البروتوكول، والذي هو امتداد الطرق التي أعلن عنها في Koene 16 آخرون، هو اختبار آثار البروتينات السائل المنوي على معايير مختلفة من وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات. ويتم إنجاز ذلك عن طريق تشريح غدة البروستاتا (أي الغدة التبعي الذكور إنتاج السائل المنوي) من القواقع المانحة معزولة جنسيا من ثقافة المختبر القياسية. الثانية، يتم جمع الحيوانات المنوية المتبرع من الحويصلات المنوية ومصنوعة حلول معاملة مختلفة. بعد ذلك، يتم اختبار القواقع مخدرة وحقن intravaginally مع حل الاختبار (على سبيل المثال،البروستاتا غدة استخراج وحده والبروستاتا غدة مع استخراج الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية وحدها، متوسطة الناقل وحده). ومن ثم يتم رصد هذه القواقع اختبار للأيام التالية لأسابيع تحت الظروف القياسية، لتسجيل وضع البيض. يتم جمع كتل البيض، مسحها رقميا لحساب وقياس معايير مختلفة، ومن ثم وضعها في قارورة الفردية لتفقيس. بعد حوالي أسبوعين، يتم الاعتماد على سلحفاة صغيرة ومسحها رقميا. جميع بالاشعة، كل من كتل البيض وسلحفاة صغيرة، ثم يتم تحليلها باستخدام بحرية المتاحة حزمة برامج تحليل الصور.
لهذا البروتوكول يستخدم سلالة المختبر من الحلزون بركة كبيرة، المنقعية الراكدة، والتي يتم تربيتها في جامعة VU في أمستردام. يخدم هذا النوع كنظام نموذج للتحقيق في أسئلة حول الانتقاء الجنسي والتكاثر في المنحرفين. حجم الحيوان كبير نسبيا يجعل من التجربة للوصول للغاية. بالإضافة إلى ذلك، لأنه يستخدم كنوع النموذج في كثير من بالتخصصات iological نحن نعرف بالفعل الكثير عن بيولوجيا الأساسية لهذه الحيوانات. وهذه الطريقة تساعد على دراسة تساؤلات حول عمليات الانتقاء الجنسي التي يتم بوساطة بروتينات السائل المنوي عن طريق بصفة عامة. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه هي المنحرفين في وقت واحد، فمن الممكن لمعالجة ما إذا كانت هذه البروتينات تعمل بطرق مشابهة و / أو مختلفة كما هو الحال في الأنواع حيث يتم فصل الجنسين 16،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
يبين بروتوكول المعروضة كيفية جمع السائل المنوي وكيفية اختبار هذه بطريقة ذات مغزى من الناحية البيولوجية. على الرغم من أن هذا الإجراء هنا يظهر البروستاتا باستخدام مستخلص الغدة، وأثر من البروتين النقي السائل المنوي احد ويمكن أيضا اختبار باتباع نفس الإجراء. من الواضح، في مثل هذه الاختبارات هو دائما حاسمة لتشمل الضوابط المناسبة (علاجات صورية) للتأكد من أن الإجراء و / أو متوسطة الناقل لا تؤثر على المعلمات في الأسئلة 14،16. باستخدام هذا الأسلوب، وقد تم بالفعل تبين أن هناك واحد من البروتين السائل المنوي، وهما Ovipostatin، التي تتوسط انخفاض في وضع البيض 14،16. هذا البروتين، ينتج في غدة البروستاتا ونقل خلال التزاوج مع الحيوانات المنوية، يمثل أول تتميز بالكامل المكون السائل المنوي في وقت واحد وخنثى لا، حتى الآن، لم تظهر أي تشابه البروتينات المعروفة.
النتيجة التي مفادها أن Ovipostaالقصدير يقلل الإنتاج الضخم البيض في المتلقي يعزز العمل في وقت سابق تشير إلى أن المواد الموجودة في السائل المنوي قد تؤثر على وضع البيض 13-15. عن طريق تحويل مبالغ بيولوجيا ذات الصلة (انظر 3.2 16)، يمكن للمرء أن تبرهن بشكل مقنع أنه هو السائل المنوي البروتين، وليس وجود الحيوانات المنوية نفسها، التي تتوسط الحد الملحوظ في وضع البيض (الشكل 1). بالنظر إلى أن استلام المتكررة من السائل المنوي عن طريق التزاوج الطبيعي يزيد من الاستثمار في البيض 15، يصبح الآن ذات أهمية كبيرة لقياس البارامترات الأخرى من وضع البيض. بروتوكول قدمت يوفر الآن الأساليب اللازمة للقيام بذلك. على الرغم من أن تم العثور على أي أثر للOvipostatin على الفقس نجاح البيض الذي تضعه المتلقي 16، قد يكون هناك غيرها من البروتينات السائل المنوي التي تعمل بالتنسيق مع هذا البروتين. وبالتالي، المعلمات التي تحتاج إلى أن يكون كميا في هذا السياق – إلى جانب وضع أرقام التردد والبيض – وتشمل حجم البيض، hatcالوقت هينج والتنمية فقس البيض وفقس البيض حجم. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن ننظر إلى الآثار المترتبة على عمليات امرأة أخرى من وضع البيض، مثل تخزين الحيوانات المنوية والاستخدام، فضلا عن تخصيص الموارد نحو الإنجابية وظيفة الإناث والذكور 14،17. بوضوح، وطريقة عرض يستفاد منه في معالجة هذه القضايا متابعة، سواء في المنقعية الراكدة وغيرها من القواقع في المياه العذبة.
باختصار، هذا المعرض التجارب باستخدام بروتوكول نقل البروتينات السائل المنوي تؤثر على الأداء التناسلي الأنثوي للمتلقي في هذه المنحرفين في وقت واحد. بالنظر إلى أن تناولت دراسات قليلة هذا، فإنه من المرجح أن يكون أكثر شيوعا في تسميد داخليا من المنحرفين وينعكس حاليا في الأدبيات العلمية. وخصوصا عندما يدرك المرء أن اختيار زميله قبل كوبولاتوري والمنافسة الحيوانات المنوية وقد ثبت أن تلعب دورا هاما في هذه المنحرفين 14، والتي highlighنهاية الخبر إمكانات ذكر مثل البروتينات الغدة الإكسسوارات التي سيتم اختيارها عن طريق الاتصال الجنسي في هذا النظام. أخيرا، يساعد هذا البحث لدعم الفكرة النامية التي بروتينات السائل المنوي لهما أهمية متساوية للالمنحرفين في وقت واحد كما هي بالنسبة للأنواع منفصلة تلاعب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر MR Helmus لأكثر من صوت، CM Popelier، S. Ypenburg وC. يفيسك للحصول على المساعدة الفنية. ويدعم هذا البحث ماليا من قبل المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO)، وهولندا الأكاديمية الملكية للفنون والعلوم (KNAW) ومنظمة خدمات الطلاب اليابان (JASSO). وأيد هذا المنشور من منحة النفاذ المفتوح من NWO إلى JMK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| fish food flakes | TetraPhyll | ||
| stereo microscope | |||
| small surgical scissors | WPI | ||
| coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| injection needles (0.3mmx13mm) | |||
| 50 Mm MgCl2 | |||
| 5.83 mmol L-1 CaCl2•2H2O | |||
| 3.76 mmol L-1 MgCl2•6H2O | |||
| 42.69 mmol L-1 NaCl | |||
| 37.53 mmol L-1 KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| blunted injection needles (0.3mmx13mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460-ml perforated containers | |||
| metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| spatula/spoon | |||
| (laptop) computer | |||
| flatbed scanner | |||
| millimeter scale | |||
| transferring plates | |||
| glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. . Male reproductive function and semen. , (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. . Sexual Conflict. , (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. . Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones”: A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
