השפעה של זכר אבזר בלוטת מוצרים בהטלת ביצים ברכיכות חלזון
Summary
This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.
Abstract
באופן פנימי דישון בעלי חיים, נוזל זרע הוא הוסיף בדרך כלל לתאי הזרע, יחד ויוצרים את הזרע או שפיכה. חוץ מזרע מזין והפעלה, הרכיבים בנוזל הזרע יכולים גם להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה הפריה של תורם הזרע. בעוד שמחקרים רבים דיווחו על תופעות כאלה במין עם מינים נפרדים, מעט מחקרים עסקו זה בבעלי החיים בו זמנית hermaphroditic. פרוטוקול וידאו זה מציג שיטה ללמוד השפעות של נוזל זרע בחלזונות, באמצעות חילזון בו זמנית hermaphroditic מים מתוקים, stagnalis Lymnaea חילזון הברכה הגדול, כמו אורגניזם מודל. בעוד ההליך מוצג באמצעות תמציות בלוטת ערמונית שלמות, רכיבים בודדים (כלומר, חלבונים, פפטידים, ותרכובות אחרות) של נוזל הזרע, ניתן לבדוק באותו אופן. השפעות של קבלת רכיבי שפיכה בנחת ביצה ניתן לכמת במונחים של תדירות של הטלת ביצים והערכות עדינות יותר של ביצועי רבייה נשיים כגון מספרי ביצה בתוך כל המוני ביצה. תוצאות מראות כי חלבוני נוזל זרע משפיעים על פלט רבייה נשי באנדרוגינוס בו זמנית זו, המדגיש את החשיבות שלהם לברירה מינית.
Introduction
עם ההעברה, תאי זרע הם בדרך כלל מלווים בנוזל זרע מיוצר על ידי בלוטות אבזר מין זכר. בעוד כמה רכיבי שפיכה לשחק תפקידים בזרע מזין והפעלת 1, אחרים להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה של הפריה של תורם הזרע 2-4. השפעות אלה נבחרו במיוחד עבור, דרך ברירה מינית, כאשר מינים הוא מופקרים ביותר ויש לו אחסון זרע יעיל ועיכול זרע. בתנאים אלה, תורמי זרע להתחרות בכבדות להפריה של ביצים 5. אמנם יש ראיות בשפע מתאמים לחשיבות של חומרי נוזל זרע להצלחת הפריה ממין זכר, עדות ישירה היא יותר נדירה וכמה מחקרים התעמקו בפרטים של השינוי ו / או חומרים מעורבים 6 הפיסיולוגיים.
במינים עם מינים נפרדים (כלומר, זכרים ונקבות; gonochorists) יש speci מודל חקר היטב כמהes כשזה מגיע להרכב נוזל זרע ואת ההשפעות שלהם. דוגמאות כוללות את זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster 6, יתושים המלריה, אנופלס 7 gambiae, וחיפושית הקמח האדומה, castaneum Tribolium 8. מחקרי נוזל זרע כאלה הם נדירים הרבה יותר כשמדובר במינים שהם בו זמנית hermaphroditic (כלומר, אנשים הם מבחינה פונקציונלית זכר ונקבה באותו הזמן), למרות שהמצב של רבייה זו הוא נפוץ בכל רחבי הממלכה 9 בעלי החיים. דוגמא hermaphroditic הבולטת ביותר של העברת חומר בלוטת אבזר היא כנראה הירי של מה שנקרא אהבה בחצי שבלולי היבשה 2,10, שבו החומר מועבר על ידי תורם הזרע באמצעות הזרקת מזרק 11,12, כלומר, לא יחד עם תאי הזרע. אבל יש הרבה הרמפרודיטים בו זמנית, כי העברת מוצרי בלוטת אבזר גבריים יחד עם הזרע שלהם,כגון מיני המודל משמשים כאן, הברכה הגדולה חילזון Lymnaea stagnalis. המחקרים קודמים כבר הוכיחו כי קבלת נוזל הזרע משפיעה על תפוקת הרבייה הנשית של מין זה 13-15, וכמה מחלבוני נוזל זרע המעורבים זוהו 16,17.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה, שהוא שלוחה של השיטות שדווחו בKoene אח' 16, היא לבדוק את ההשפעות של חלבוני נוזל זרע על פרמטרים שונים של הטלת ביצים ברכיכות חלזון. המטרה זו מושגת על ידי נתיחה של בלוטת הערמונית (כלומר, בלוטת האבזר הגברית ייצור נוזל הזרע) של חלזונות תורם מבודדים מבחינה מינית מתרבות מעבדה סטנדרטית. שנית, הזרע של התורם נאסף משלפוחית הזרע ופתרונות טיפול שונים עשויים. בהמשך לכך, חלזונות מבחן הם מורדמים וintravaginally הוזרקו פתרון מבחן (לדוגמא,תמצית בלוטת ערמונית לבד, תמצית בלוטת ערמונית עם זרע, זרע לבד, בינוני נושאת לבדה). אז חלזונות מבחן אלה במעקב במשך הימים הבאים לשבועות, בתנאים סטנדרטיים, להקליט הטלת ביצים. המוני ביצה נאספים, באופן דיגיטלי שנסרקו לספירה ומדידת פרמטרים שונים, ולאחר מכן לשים בצלוחיות אישיות לבקיעה. לאחר כשבועיים, הגוזלים נספרים ונסרקו באופן דיגיטלי. כל הסריקות, שבשני המוני ביצה וגוזלים, לאחר מכן נותחו באמצעות חבילת תוכנת ניתוח תמונה באופן חופשי, זמינה.
לפרוטוקול זה משמש זן המעבדה של החילזון הגדול בריכה, stagnalis Lymnaea,, שהוא גידל באוניברסיטת VU באמסטרדם. מין זה משמש כמערכת מודל לחקר שאלות על בחירה ורבייה בהרמפרודיטים מיניות. הגודל הגדול יחסית של בעלי החיים עושה את זה באופן ניסיוני מאוד נגיש. בנוסף לכך, משום שהוא משמש כמיני מודל ברבים בדיסציפלינות iological אנחנו כבר יודעים הרבה על הביולוגיה הבסיסית של בעלי חיים אלה. שיטה זו תעזור לשאלות מחקר על תהליכים של ברירה מינית שמתווכים באמצעות חלבוני נוזל זרע באופן כללי. בנוסף, מכיוון שמדובר בהרמפרודיטים בו זמנית, זה אפשרי כדי לטפל באם חלבונים כגון לפעול בדרכים דומות ו / או שונות כפי שהם עושים במינים שבם המינים מופרדים 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המובא מראה כיצד לאסוף נוזל זרע ואיך לבדוק את זה בצורה משמעותית מבחינה ביולוגית. למרות שהליך זה כאן מוצג באמצעות תמצית בלוטת הערמונית, ההשפעה של חלבון נוזל זרע מטוהר יחיד יכולה להיות גם נבדקה באותו האופן. כמובן, בבדיקות כגון זה תמיד חיוני לכלול בקרות נאותות (טיפולי דמה) כדי להבטיח שההליך ו / או בינוני הספק אינו משפיע על הפרמטרים בשאלות 14,16. באמצעות שיטה זו, שהיא כבר הראתה כי קיימת חלבון יחיד נוזל זרע, כלומר Ovipostatin, שמתווך בירידה בהטלת ביצים 14,16. חלבון זה, המיוצר בבלוטת הערמונית והועבר במהלך הזדווגות יחד עם תאי הזרע, מייצג את המרכיב הראשון המאופיין במלואו נוזל הזרע באנדרוגינוס בו זמנית ואין, עד כה, לא הראה שום דמיון לחלבונים ידועים.
הממצא שOvipostaפח מפחית ייצור המוני ביצה בנמען מאשש עבודה קודמת מצביע על כך שחומרים בזרע עשויים להשפיע על הטלת ביצי 13-15. על ידי העברת סכומים רלוונטיים מבחינה ביולוגית (ראה 3.2 16), אפשר באופן משכנע להוכיח כי מדובר בחלבון נוזל זרע, ולא הנוכחות של תאי זרע עצמם, שמתווך את הירידה שנצפתה בהטלת ביצים (איור 1). בהתחשב בכך שקבלה חוזרת של נוזל זרע דרך הזדווגויות טבעיות מגדילה את ההשקעה לביצה 15, עכשיו זה הופך להיות רלוונטי מאוד לכמת פרמטרים אחרים של הטלת ביצים. הפרוטוקול הציג החברה מספק את השיטות הדרושות כדי לעשות זאת. למרות שלא נמצאה השפעה של Ovipostatin על בקיעת הצלחה של הביצים שהונחו על ידי הנמען 16, ייתכנו חלבוני נוזל זרע אחרים שיפעלו בתיאום עם חלבון זה. לפיכך, פרמטרים שצריכים לכמת בהקשר זה – בסמוך לנחת מספרי תדירות וביצה – כוללים גודל ביצה, hatcזמן הינג, פיתוח גוזל וגודל גוזל. בנוסף, אפשר להסתכל על השפעות על תהליכים אחרים נשיים מאשר הנחת ביצה, כגון אחסון זרע ושימוש, כמו גם הקצאת משאבי רבייה כלפי התפקוד הנשי וגברי 14,17. ברור שהשיטה שהוצגה היא סייע בטיפול בנושאי מעקב אלה, הן בLymnaea stagnalis ובחלזונות מים מתוקים אחרים.
לסיכום, ניסויים באמצעות הצגת פרוטוקול זה שהעביר את חלבוני נוזל זרע משפיעים על ביצועי רבייה הנשיים של הנמען בהרמפרודיטים בו זמנית אלה. בהתחשב בכך שמספר מחקרים התייחסו הזה, זה עשוי להיות הרבה יותר נפוץ באופן פנימי דישון הרמפרודיטים מאשר כיום משתקף בספרות המדעית. במיוחד כאשר אחד מבין שבחירת בן זוג לפני הזדווגות ותחרות הזרע הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהרמפרודיטים אלה 14, שhighlights הפוטנציאל של חלבוני בלוטת אבזר גבריים כגון להיבחר מיני במערכת זו. לבסוף, מחקר זה מסייע לתמיכה ברעיון הפיתוח שחלבוני נוזל זרע הם בעלי חשיבות שווה להרמפרודיטים בו זמנית כפי שהם למיני דחף מיניים נפרדים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר Helmus לקריינות, CM Popelier, ס 'Ypenburg וג ווסק לקבלת סיוע טכני. מחקר זה נתמך כלכלית על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO), רויאל הולנד האקדמיה לאמנויות ולמדעים (KNAW) והארגון ליפן סטודנטים השירותים (JASSO). פרסום זו נתמכה על ידי מענק פתוח פתוח של NWO לJMK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| fish food flakes | TetraPhyll | ||
| stereo microscope | |||
| small surgical scissors | WPI | ||
| coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| injection needles (0.3mmx13mm) | |||
| 50 Mm MgCl2 | |||
| 5.83 mmol L-1 CaCl2•2H2O | |||
| 3.76 mmol L-1 MgCl2•6H2O | |||
| 42.69 mmol L-1 NaCl | |||
| 37.53 mmol L-1 KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| blunted injection needles (0.3mmx13mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460-ml perforated containers | |||
| metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| spatula/spoon | |||
| (laptop) computer | |||
| flatbed scanner | |||
| millimeter scale | |||
| transferring plates | |||
| glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. . Male reproductive function and semen. , (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. . Sexual Conflict. , (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. . Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones”: A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
