Effect van Accessory Gland producten op eierleggende in buikpotigen

1. Fokkerij Verkrijgen volwassen exemplaren van Lymnaea stagnalis (L.) uit een laboratorium cultuur zoals die aan de Vrije Universiteit. Handhaaf het lage koper water van 20 ° C in zowel de fokkerij (molluscarium) en experimentele tanks, die continue water uitwisseling hebben. Zet de licht / donker cyclus bij 12 uur: 12 uur. Voor de fokkerij, voeden de volwassen slakken onbespoten sla ad libitum, voeden de jonge jongeren met TetraPhyll (visvoer) vlokken. Handhaaf slakken in aparte tanks volgens hun leeftijd, vanaf ei massa's die worden gelegd binnen een 24 uur tijdsbestek. Zodra slakken uit de kweekbakken ze niet teruggekeerd, de effecten van voorkomen hebben onder enigszins verschillende omstandigheden alsmede pseudoreplication voorkomen gehouden. 2. Dissection Isoleer de slakken voor 1 week, en voer ze ad libitum, naar tha zorgent ze vol sperma en zaadvocht winkels. Bereid een stereo-microscoop, een dissectie plaat met pinnen, kleine chirurgische schaar, grove en fijne tang, een 10 ml spuit gevuld met een 50 mM MgCl2 oplossing, injectienaalden (0,3 mm x 13 mm) en wat keukenpapier. Euthanaseren een slak door het injecteren van MgCl2-oplossing (meestal 3 ml of meer voor volwassen slakken met een schelp lengte van 31,6 ± 2,1 mm en nat gewicht van 2,89 ± 0,55 g). Doordringen in de voet met de injectienaald in een hoek van 45 ° en spuit door zachtjes druk uit te oefenen continu totdat de slak ontspant en blijft verlengd (binnen enkele seconden). Verwijder de injectienaald en controleer of de slak wordt gedood (bijvoorbeeld door te controleren of de tentakel terugtrekking reflex afwezig is). Verwijder voorzichtig de dop na de kromming door het gebruik van grof tang. Halverwege, voorzichtig los de columellar spier van het reservoir door schrapen met de tang. Draai zachtjes thij slak uit zijn schelp, het kronkelende richting van de schelp. Plaats de slak op de dissectie plaat en pin vaststelling van de achterkant van de voet. Plaats dan een pin door het hoofd en doe er wat spanning op de slak om dissectie vergemakkelijken. Lokaliseer de vrouwelijke gonopore, die later op een referentiepunt voor dissectie zal zijn. De chirurgische schaar en fijne tang, maken het eerste incisie net onder de rand van de mantel en snijd naar de vrouwelijke gonopore. Wanneer een van de bladen schaar 'onder het lichaam muur wordt gedrukt, til het iets omhoog om ervoor te zorgen dat alleen het lichaam muur, en geen van de interne organen, wordt gesneden. Blijven snijden boven de gonopore naar het hoofd en snijd in een rechte lijn. Lokaliseren van de prostaat (posterior) en zaadblaasjes (anterior). Ontleden deze uit en bewaar ze op ijs. Gebruik deze om de testoplossingen met zaadvocht en / of sperma te maken. Gebruik fysiologische Lymnaea saline (5,83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37,53 mmol / L KCl) als dragermedium. Verzamel de zaadvloeistof die in het lumen van de prostaat en de sperma van de zaadblaasjes is. Vervolgens schorsen zowel in zoutoplossing in afzonderlijke flacons door voorzichtig het uiten van hun inhoud en het verwijderen van het orgaan weefsel met een pincet. Blijf op ijs en maken gebruik van dezelfde dag. Later, meng deze suspensies om de verschillende behandeling oplossingen te creëren. 3. Intravaginale Injectie Alvorens de intravaginale injectieprocedure, stelt een siliconen omhulsel-vorm (aan het uiteinde van het reservoir past), 1 mm spuiten, 10-12 cm siliconenslang met een diameter van 1 mm, stomp injectienaalden (0,3 mm x 13 mm ), grof tang en dezelfde 10 ml spuit, gevuld met een 50 mM MgCl2-oplossing voorzien van een scherpe injectienaald. Verzamel de zaadcellen, die nodig zijn om toe te voegen aan de zaadvloeistof (of individuele zaadvocht eiwitten) in sommige behandelingen; een biologisch relevante dosis is gelijk aan 1/3 van een prostaat en zaadblaasjes per injectie. OPMERKING: In de resultaten representatief deel (figuur 1) de resultaten van een experiment met drie verschillende behandelingen worden getoond: Controle (dragermateriaal, dat wil zeggen, zoutoplossing), Ovipostatin (een van de geïdentificeerde zaadvocht eiwitten) alleen en Ovipostatin gepaard met sperma. Ook de biologisch relevante dosis bij andere soorten schatten bepalen het verschil in gewicht van de prostaat individuen die onlangs gepaard en individuen die overbleven seksueel geïsoleerde 16. Bereid 1 ml spuiten voor elk van de bereide testoplossingen. Vul elke spuit met een oplossing en ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in. Monteer een afgestompte injectienaald op elke spuit. Voor injectie gebruiken een 1mm siliconenslang met een lengte van 10 cm hoogte. Schuif de siliconenslang over de injectienaald, zorg ervoor dat de buis niet te doorboren, en verwijder de lucht uit de buis door voorzichtig het toepassen van de druk op de spuit. Verdoven een slak door het volgen van hetzelfde protocol als in punt 2.3. Deze keer zorg ervoor dat meer dan 2-3 ml 50 mM MgCl2 niet te injecteren. Leg de slak in de schelp-mal om het in een stabiele positie te houden. Zoek de vrouwelijke gonopore, dat duidelijk zichtbaar als witte vlek op de rechterzijde van het dier, voorafgaande aan de juiste tentakel en mannelijke gonopore (deze plaats geldt ook voor andere soorten van zoetwater slakken). Zorg ervoor dat u vrij toegang hebben. Gebruik een tang om het einde van de siliconenslang houden en breng dan ongeveer 2-4 mm van de siliconenslang in het vrouwelijke gonopore. Breng zorgvuldig druk op de spuit en injecteer 0,03 ml van de testoplossing. Wacht een half minute de druk in de buis te verspreiden in de vrouwelijke tractus alvorens de buis mogelijk. De terugkeer van de behandelde slak aan zijn isolement container, waar het kan worden gecontroleerd, en laat het herstellen van sedatie in de experimentele tank. 4. Bioassay Label elke slak voor de identificatie en meet zijn schelp lengte. De laatste is een goede indicator van de omvang, die relevant is kwantificering voortplantingsresultaat. Houd elke slak geïsoleerd in een 460 ml container die is geperforeerd om voor water-uitwisseling binnen de experimentele tank. Het is belangrijk dat alle containers in de juiste oriëntatie met de perforaties in de richting van de waterstroom, zodat efficiënte waterverversing. Tijdens de biologische, voeden slakken regelmatig met een gestandaardiseerde hoeveelheid van sla. Gebruik een ronde, metalen puncher om sla te snijden. In dit protocol sla schijven van 19,6 cm2 worden gebruikt, die een benadertmonteer ze maximaal kunnen eten in een dag. Verzamel een ei massa met de platte kant van een spatel en schraap het ei massa van de container muur. Gebruik de lepel kant om het ei massa te verzamelen. OPMERKING: Ondoorzichtige ei massa's die net zijn gelegd kunnen niet worden gebruikt voor het scannen (ze transparant worden binnen een paar uur na het leggen). Voor het model soorten in dit protocol, Lymnaea stagnalis, controleer ei massa's elke dag, omdat ze produceren 2-3 ei massa's per week. Dit kan verschillen bij andere soorten. Scan de verzamelde ei massa's digitaal, met behulp van een (laptop) computer met de scanner driver, een flat bed scanner, een standaard millimeter schaal, een spatel, het overbrengen van borden en glazen tegels. Plaats elk ei massa op de overdracht platen en herhalen totdat de platen vol. Vervolgens dep de ei massa droog op keukenpapier en overbrengen op het glas tegels in dezelfde volgorde als de overdracht platen. Draai elke tegel ondersteboven (deei massa zal vasthouden aan de glazen tegel) en leg hem voorzichtig op de flatbed scanner, net onder de millimeter schaal. Breng een beetje druk om het ei massa's plat, die gelijkmatig zal verdelen de eieren zodat ze allemaal zichtbaar binnen dezelfde focus vliegtuig. Monteer de tegels met een gestandaardiseerde hoeveelheid tape rond twee kanten om te verzekeren dat alle eieren gelijk worden afgevlakt. Pas de scanner instellingen. Het is belangrijk om de resolutie tot de maximale passen, maak een voorbeeld scan, bijsnijden het werkgebied, en pas de helderheid en het contrast. Scan de ei massa. Leg elk ei massa voor haar eigen label 20 ml glazen flacon voor verdere ontwikkeling en broedeieren. Vernieuw het water in het uitbroeden flesjes om de andere dag om het goed zuurstofrijk te houden. Doe dit volgens hatchling aantallen en grootte in de volgende volgorde: decanteren / afgieten (geen jongen), overlopen (begin van broedeieren) en extraheren uit het water met een pipet (veel jongen). <p class = "jove_title"> 5. Meten en tellen Eieren Installeer de vrij verkrijgbare software voor beeldanalyse ImageJ (NIH, USA) en de cel teller plugin. Open ImageJ evenals een spreadsheetprogramma om de gegevens aan. Vervolgens opent u een gescande foto van ei massa's in ImageJ. Zet de schaal met behulp van de zoom-functie om te navigeren op de millimeter schaal. Zoom in en het venster aan te passen voor 1 mm tot het scherm opvullen. Trek een lijn met de lijn gereedschap tussen de twee lijnen die 1 mm aan te geven. Navigeer naar Analyseren en Set schaal. In het pop-upmenu de gemeten lengte optie zichtbaar, passen Bekende afstand tot 1 en eenheid van lengte mm. Vink het vakje Global, en sluit het venster. Stel de gewenste metingen (lengte, breedte, omtrek) door te navigeren naar Analyseren en Set Metingen door Ruimte en Feret Diameter (lengte en breedte) te selecteren. Klik op OK om te bevestigen en door te gaan met het beeld analyseert. Om de eieren te meten, ZoOm in op een ei van de eerste ei massa die moet worden gemeten. Een zoom van 800% wordt aanbevolen. Dan, met behulp van de elliptische gereedschap tekenen een ovaal precies rond het ei, druk op Ctrl + D om de omtrek te tekenen op de afbeelding (om te voorkomen dat het meten van dezelfde ei tweemaal). Druk dan op ctrl + M om de maatregel van de eigenschappen van het ovaal (lengte, breedte, omtrek) registreren; een pop-up scherm geopend met de metingen. OPMERKING: Het gebruik van de elliptische tool om eieren te meten geldt niet voor alle soorten. Voor soorten met niet-gelijkmatig gevormde eieren, gebruikt u de vrije hand selecties plaats. Meet zoveel eieren als nodig en sla de maatregelen. Xls werkblad. Eventueel, kopieert u de gegevens rechtstreeks in een werkblad. Vervolgens tellen de eieren in een ei massa, met behulp van de teller-venster en zet de tellingen handmatig in het werkblad. Als alternatief, de telling van de individuele eieren per ei massa met de hulp van de cel contra plug-in. Hiervoor gaat u naar plug-ins,vervolgens, Analyseren en selecteer Celgetalmeter. Het venster celgetalmeter verschijnt, controleert u de 'Bewaar de originele' vakje en druk op 'initialiseren'. Een nieuwe teller verschijnt, selecteert u de crosshair op de werkbalk en selecteer een teller in het menu cel teller. Tel de individuele eieren door te klikken op de individuele eieren in de cel teller venster. Let op de totale telling naast het type teller in het menu cel teller. Kopieer dit nummer handmatig in een spreadsheet of de resultaten te verkrijgen door op Resultaten. Count meerdere ei massa binnen een telling evenement door het toevoegen van soorten tegen te gaan, indien nodig.