Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Метод оценки способности изолированных мыши альвеолярных макрофагов контролировать рост фагоцитирующих спор Aspergillus с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
Легких является интерфейсом, где клетки-хозяева регулярно подвергается микробов и микробных продуктов. Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных грибки и другие микробы. Макрофаги и другие иммунные клетки распознают Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена и инициировать вниз по течению воспалительных реакций. Фагоцитов НАДФН оксидазы генерирует реактивные промежуточные кислорода (Rois) и имеет решающее значение для защиты организма. Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты 1 – 3, важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Целью данного исследования было очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры 4. Здесь мы опишем метод для оценки способности мышьlveolar макрофаги (AMS), чтобы контролировать рост фагоцитированы Aspergillus спор (конидий). Альвеолярные макрофаги окрашивают в естественных условиях и десять дней спустя изолированы от мышей бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Макрофаги высевали на покровные стекла, затем вносят затравку зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессирующих A. fumigatus споры. В определенные моменты, клетки фиксируют и количество интактных макрофагов с фагоцитирующих спор оценивают с помощью конфокальной микроскопии.
Introduction
Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных микробы. Макрофаги признать Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена, глотать и ограничить рост ингаляционных спор (конидий), и инициировать воспалительные реакции. Фагоцитов НАДФН оксидазы преобразует молекулярный кислород к супероксиданиона и вниз по течению реактивных промежуточных кислорода (Rois). Хроническая гранулематозная болезнь (КГД) является наследственным расстройством НАДФН-оксидазы характеризуется тяжелых бактериальных и грибковых инфекций и чрезмерными воспалительных реакций.
Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты 1 – 3, важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Предыдущие исследования показали, что альвеолярные макрофаги поглощают и убивают Aspergillus споры, в то время как нейтрофилы главным целевой этап гиф 5. Тем не менее, были противоречивыми Resulц как на роль НАДФН-оксидазы в макрофагов в борьбе с ростом А. fumigatus споры 6, 7.
Цель этого метода в том, чтобы очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus споры. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры 4. Чтобы наиболее точно смоделировать реакцию хозяина к ингаляционных грибов, мы использовали альвеолярных макрофагов собирают бронхоальвеолярного лаважа с нестимулированных мышей сразу после жертвоприношения. Использование изолированных альвеолярных макрофагов позволило нам сосредоточиться на своей противогрибковой активности в отсутствие других иммунных клеток (например, завербованные нейтрофилов), которые защищают против Aspergillus в естественных условиях. В этом методе, альвеолярных макрофагов окрашивали в естественных условиях до сбора таким образом, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции. </ Р>
Еще одно преимущество этого протокола является использование GFP-экспрессирующих А. fumigatus штамм. Этот гриб выражает GFP из конидиального этапе через стадию гиф и не имеет необходимость дальнейшего окрашивания. Для получения изображения с более подробно, мы выбрали конфокальной микроскопии, который позволит реконструкцию трехмерных структур из полученных изображений. Трехмерная реконструкция дает возможность различать гифы растет во всем, а не в или через макрофагов. Конидии также может быть точно различают как внутриклеточный против внеклеточного.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя этот подход для экс естественных анализа противогрибковой активности макрофагов вместе с в естественных грибковой вызов, мы ранее показали, что NADPH оксидазы в макрофагах играет важную роль в защите от А. fumigatus 4. Использование изолированных альвеолярных м…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Грант R01AI079253 (к BHS) и Национальным институтом рака онкологический центр поддержки Грант CA016056 в Roswell Park института рака.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
