Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie
Summary
Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.
Abstract
Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 – 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.
Introduction
Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen.
Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 – 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Alveolarmakrophagen aufnehmen und töten Aspergillus-Sporen, während Neutrophilen hauptsächlich gezielt die Hyphen Stufe 5. Jedoch gibt es widersprüchliche Results in Bezug auf die Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Kontrolle des Wachstums von A. fumigatus Sporen 6, 7.
Das Ziel dieser Methode war, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Wirtsabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus Sporen. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Pilze, verwendeten wir Alveolarmakrophagen von BAL geerntet von nicht-stimulierten Mäusen unmittelbar nach der Tötung. Die Verwendung von isolierten alveolaren Makrophagen konnten wir auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren. In diesem Verfahren wurden Alveolarmakrophagen in vivo vor gefärbt, um so zu ernten, um die Menge der nach der Ernte Manipulation zu minimieren. </ P>
Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, entschieden wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. 4 fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institute of Allergy and Infectious Disease Zuschuss R01AI079253 (BHS) unterstützt und von der National Cancer Institute Cancer Center Support Grants CA016056 nach Roswell Park Cancer Institute.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
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