La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal
Summary
Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.
Abstract
El pulmón es una interfaz donde células huésped están expuestos rutinariamente a los microbios y productos microbianos. Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran los hongos y otros microbios inhalados. Los macrófagos y otras células inmunes reconocen motivos de Aspergillus por receptores de reconocimiento de patógenos e iniciar respuestas inflamatorias aguas abajo. La oxidasa NADPH fagocítica genera intermediarios reactivos del oxígeno (ROI) y es fundamental para la defensa del huésped. Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos 1 – 3, la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. El objetivo de este estudio fue definir el papel específico de la NADPH oxidasa en macrófagos en la mediación de la defensa del huésped contra A. fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas 4. Aquí se describe un método para evaluar la capacidad de un ratónmacrófagos lveolar (AMS) para controlar el crecimiento de las esporas de Aspergillus fagocitados (conidios). Los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo y diez días después aisladas de ratones por lavado broncoalveolar (BAL). Los macrófagos se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio, y luego sembraron con la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan A. esporas fumigatus. En momentos determinados, las células se fijan y el número de macrófagos intactas con esporas fagocitados se evaluaron por microscopía confocal.
Introduction
Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran con microbios inhalados. Los macrófagos reconocen motivos Aspergillus por los receptores de reconocimiento de patógenos, ingieren y limitan el crecimiento de las esporas inhaladas (conidios), e inician la respuesta inflamatoria. La NADPH oxidasa de los fagocitos convierte oxígeno molecular para el anión superóxido y intermediarios reactivos del oxígeno aguas abajo (Rois). La enfermedad granulomatosa crónica (CGD) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones bacterianas y fúngicas graves y por las respuestas inflamatorias excesivas.
Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos 1 – 3, la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. Estudios anteriores han demostrado que los macrófagos alveolares ingerir y destruir las esporas de Aspergillus, mientras que los neutrófilos se dirigen principalmente a la etapa de las hifas 5. Sin embargo, ha habido Resul en conflictoTS como para el papel de la NADPH oxidasa en macrófagos en el control del crecimiento de A. fumigatus esporas 6, 7.
El objetivo de este método era para delinear el papel específico de la NADPH oxidasa en los macrófagos en la mediación de la defensa del huésped frente a A. esporas fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas 4. Para modelar más de cerca la respuesta del huésped a los hongos inhalados, utilizamos los macrófagos alveolares cosechadas por lavado broncoalveolar de los ratones estimulados inmediatamente después del sacrificio. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos ha permitido centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células del sistema inmune (por ejemplo, neutrófilos reclutados) que defienden contra Aspergillus in vivo. En este método, los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo antes de la cosecha a fin de minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha. </ P>
Otra ventaja de este protocolo es el uso de un GFP-expresando A. cepa fumigatus. Este hongo expresa GFP desde la etapa de conidios por la etapa de hifas y no tiene necesidad de una mayor tinción. Para obtener imágenes con mayor detalle, se optó por la microscopía confocal, que permite la reconstrucción de las estructuras tridimensionales a partir de las imágenes obtenidas. Reconstrucción tridimensional da la capacidad de diferenciar entre las hifas en crecimiento alrededor en lugar de en o a través de un macrófago. Las conidias también puede ser precisamente distingue como intracelular frente extracelular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de este enfoque para el análisis ex vivo de la actividad antifúngica de los macrófagos junto con in vivo de exposición fúngica, Hemos demostrado anteriormente que la NADPH oxidasa en macrófagos desempeña un papel importante en la defensa contra A. fumigatus 4. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos permite centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células inmunes (por ejemplo, los neutrófilos reclutados) que defienden contra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de Grant R01AI079253 (a BHS) y por el Instituto Nacional del Cáncer Centro del Cáncer de subvención de apoyo CA016056 al Instituto del Cáncer Roswell Park.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
