Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie
Summary
Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.
Abstract
De long is een interface waarbij gastheercellen routinematig worden blootgesteld aan microben en microbiële producten. Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde schimmels en andere microben tegenkomen. Macrofagen en andere immuuncellen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren en initiëren downstream ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase genereert reactieve zuurstof tussenproducten (ROI) en is van cruciaal belang voor de afweer. Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer 1 – 3, het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Het doel van deze studie was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen af te bakenen in het bemiddelen afweermechanismen tegen A. fumigatus. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen 4. Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van het vermogen van de muis eenlveolar macrofagen (AM's) om de groei van Aspergillus gefagocyteerd sporen (conidia) regelen. Alveolaire macrofagen zijn gekleurd in vivo en tien dagen later geïsoleerd van muizen door bronchoalveolaire lavage (BAL). Macrofagen uitgeplaat op dekglaasjes, dan geënt met groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie A. fumigatus sporen. Op bepaalde tijdstippen worden cellen gefixeerd en het aantal intacte macrofagen met gefagociteerde sporen wordt beoordeeld door confocale microscopie.
Introduction
Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde microben tegenkomen. Macrofagen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren, innemen en beperken de groei van geïnhaleerde sporen (conidiën), en initiëren ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase zet moleculaire zuurstof om superoxide anion en downstream reactieve zuurstof tussenproducten (ROI). Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige bacteriële en schimmelinfecties en overmatige ontstekingsreacties.
Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer 1 – 3, het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat alveolaire macrofagen innemen en doden Aspergillus sporen, terwijl neutrofielen voornamelijk richten op de hyphal fase 5. Er zijn tegenstrijdige results over de rol van NADPH oxidase in macrofagen in het beheersen van de groei van A. fumigatus sporen 6, 7.
Het doel van deze methode was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen bakenen als mediator afweermechanismen tegen A. fumigatus sporen. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen 4. Het nauwst model van de gastheer op geïnhaleerd schimmels, gebruikten we alveolaire macrofagen geoogst door bronchoalveolaire lavage van gestimuleerde muizen onmiddellijk na offer. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen stelde ons in staat om zich te concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijv. aangeworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo. Bij deze werkwijze werden alveolaire macrofagen gekleurd vivo voor zo oogst om de hoeveelheid post-harvest manipulatie minimaliseren. </ P>
Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een GFP-expressie A. fumigatus stam. Deze schimmel uitdrukking GFP uit de conidiale stadium door de hyphal podium en heeft geen behoefte aan verdere kleuring. Om beelden met meer detail bieden we kozen confocale microscopie die de reconstructie van driedimensionale structuren van de verkregen beelden maakt. Drie-dimensionale reconstructie geeft de mogelijkheid om tussen hyfen groeien rond plaats of door een macrofaag. Conidia kan ook juist onderscheiden als intracellulaire versus extracellulair.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met deze aanpak voor ex vivo analyse van de antifungale activiteit van macrofagen met in vivo schimmel uitdaging we eerder aangetoond dat NADPH oxidase in macrofagen een belangrijke rol in de verdediging tegen A. speelt fumigatus 4. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen kunnen wij concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijvoorbeeld geworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo. <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten Grant R01AI079253 (tot BHS), en door het National Cancer Institute Cancer Support Grant CA016056 naar Roswell Park Cancer Institute.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
