Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры<em> Entamoeba гистолитика</em> Инфекция
Summary
Инфекции человека на Entamoeba гистолитика приводит к амебиаза, одной из основных причин диареи в тропических странах. Инфекция инициируется патогена взаимодействия с эпителиальных клеток кишечника, провоцируя открытие межклеточных контактов и, следовательно, понос, иногда с последующим инфекции печени. Эта статья представляет собой модель для оценки ранние хост-патогенных взаимодействия для улучшения нашего понимания амебиаза патогенеза.
Abstract
Entamoeba гистолитика является возбудителем человеческого амебиаза, одной из основных причин диареи и печеночной абсцесса в тропических странах. Заражение инициируется взаимодействием возбудителя с эпителиальных клеток кишечника. Это взаимодействие приводит к нарушению межклеточных структур, таких как плотных контактов (TJ). TJ обеспечить герметизацию эпителиального слоя, чтобы отделить ткани хозяина от просвета кишечника. Недавние исследования свидетельствуют, что нарушение TJ паразитной EhCPADH112 белка является необходимым условием для Е. гистолитика вторжение, которое сопровождается эпителиального барьера дисфункции. Таким образом, анализ молекулярных механизмов, вовлеченных в TJ разборки во E. гистолитика вторжение имеет первостепенное значение для улучшения нашего понимания амебиаза патогенеза. В данной статье представлен простой модель, которая позволяет оценку начальных хост-патогенных взаимодействий и паразит вторжения потенциал. Параметры, которые будут проанализированы включают тransepithelial электрическое сопротивление, взаимодействие EhCPADH112 с эпителиальных поверхностных рецепторов, изменения в экспрессии и локализации эпителиальных соединительных маркеров и локализации молекул паразита внутри эпителиальных клеток.
Introduction
Entamoeba гистолитика является одним простейшим ответственность человеческой амебиаза, кишечной инфекции клеток вызывая воспаление и диарею. E. гистолитика заражает до 50 млн. человек в год, но только около 10% инфицированных людей развивается симптомы, связанные с амебиаза 1. Заражение происходит при употреблении зараженной пищи или воды, содержащее Е. гистолитика кисты. В кишечнике, кисты производят живые трофозоиты, которые придерживаются толстой кишки муцина и размножаться 2. Трофозоиты обычно образуют цисты, которые выводятся из организма через стул. В других случаях и для еще неизвестным причинам, трофозоиты сломать кишечного эпителиального слоя и вторгнуться подлежащих тканей. В худшем случае, они входят в кровь и влияют на другие органы, такие как печень 3.
Разорвать эпителиальный барьер требуется разрушение эпителиальных transmembranal структур, которые поддерживают клетки присоединились. Эпителиальных клетокконтакты образованы апикальной соединительного комплекса, состоящего из жесткой (TJ) и слипчивых соединений (AJ), и десмосомы 4. Наиболее вершинные узлы: TJ, и поэтому они являются первым барьером оскорблена Е. гистолитика и некоторые другие патогены во время пребывания вторжения. TJ состоят из transmembranal рецепторов адгезии, таких как клаудины, occludin и соединительных молекул адгезии (джем), которые участвуют в гомо-или гетерофильных взаимодействий с рецепторами соседней камере. Они внутри клетки связаны молекул лесов этих блокатора малой зоны (ZO) семьи, которые соединяют адгезионные рецепторы к цитоскелета предоставить дополнительную механическую прочность эпителия. TJ ответственны за герметизации кишечной ткани из просвета кишечника, предотвращая чрезмерную утечку воды и растворенного вещества. Таким образом, после TJ нарушается паразитом, ткани вторглись. Е. гистолитика выделяет несколько молекул, таких как: (I), кто участвует в адгезии амеб в ТаргET клетки 5; (II) мембранные-активные факторы, участвующие в гибели клеток-хозяев по экзоцитоза, например ионного канала формирования пептиды названы amoebapores 6,7; и (III) протеиназы, унижающие белки внеклеточного матрикса и опосредуют ткани распада 5,8,9.
Цистеин протеазы EhCP112 и молекулы адгезии EhADH112, что вместе образуют комплекс EhCPADH112 два Е. гистолитика вирулентности белки, которые играют важную роль в разборки TJ 10. Текущие трофозоиты, их всего лизаты и секретируется продукты индуцируют молекулярные изменения в TJ сложной и функционального нарушения эпителиального барьера. В этом исследовании, было показано, что EhCP112 и EhADH112 взаимодействовать с occludin и Claudin-1 белков, приводящих к интернализации и деградации клеточных белков, способствуя тем самым E. вход гистолитика через парацеллюлярной пути.
Наши данные и те, ое другие группы 11-17 настоятельно рекомендуем необходимость конкретных принимающих-патоген взаимодействий, которые позволяют паразита вторжение. Раскрытие молекулярную основу этих взаимодействий имеет первостепенное значение для лучшего понимания амебиаза патогенеза. Селективный нарушение TJ по трофозоитов, характеризующихся повышенной проницаемостью парацеллюлярной, может быть измерена путем уменьшения трансэпителиального электрического сопротивления (TER). Перенос паразитных белков к хост-эпителии может быть определена путем иммунофлуоресценции окрашивание и конфокальной лазерной микроскопии, методом, который также может выявить совместную локализацию амебы факторов вирулентности с эпителиальными соединительных маркеры, указывающие на возможные прямые взаимодействий. В этой статье мы подробно описывают, как эпителиальные клетки и трофозоиты культивируются, собирают и манипулировать, чтобы изучить хост-патогенных взаимодействий и их последствия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для изучения в пробирке хост-патогенных взаимодействий во время эпителиальной инфекции E. гистолитика, очень важно работать с хорошо известными культурами обеих эпителиальных клеток и трофозоитов. Например, ранее, Е. гистолитика культуры были, как правило, были созданы в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
