ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em> Histolytica Entamoeba</em> זיהום
Summary
הדבקת בני אדם על ידי Entamoeba histolytica מובילה לamoebiasis, גורם עיקרי לשלשולים בארצות טרופיות. זיהום הוא ביוזמת אינטראקציות הפתוגן עם תאי אפיתל במעי, מעורר הפתיחה של אנשי קשר תאי תאים וכתוצאה מכך שלשולים, לפעמים אחריו דלקת בכבד. מאמר זה מספק מודל כדי להעריך את האינטראקציות בין המאכסן לפתוגן מוקדם כדי לשפר את ההבנה של הפתוגנזה amoebiasis שלנו.
Abstract
histolytica Entamoeba הוא סוכן סיבתי של amoebiasis האנושי, גורם עיקרי לשלשולים ומורסה בכבד בארצות טרופיות. זיהום הוא שיזם את האינטראקציה של הפתוגן עם תאי אפיתל במעי. אינטראקציה זו מובילה לשיבוש של מבנים אינטר כגון צמתים הדוקים (TJ). TJ להבטיח איטום של שכבת האפיתל להפריד רקמת מארח מלומן מעיים. מחקרים שנעשה לאחרונה מספקים ראיות לכך שהשיבוש של TJ ידי EhCPADH112 החלבון הטפילה הוא תנאי הכרחי לE. פלישת histolytica שמלווה בחוסר תפקוד מחסום האפיתל. לפיכך, הניתוח של מנגנונים מולקולריים מעורבים בפירוק TJ במהלך E. פלישת histolytica היא בעלת חשיבות עליונה לשיפור ההבנה של הפתוגנזה amoebiasis שלנו. מאמר זה מציג מודל קל המאפשר ההערכה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ראשוניים ופוטנציאל פלישת הטפיל. פרמטרים כדי להיות מנותחים כוללים tהתנגדות ransepithelial חשמל, אינטראקציה של EhCPADH112 עם רצפטורים אפיתל פני השטח, שינויים בביטוי ולוקליזציה של סמני junctional אפיתל ולוקליזציה של מולקולות טפיל בתוך תאי אפיתל.
Introduction
histolytica Entamoeba הוא protozoan תא בודד אחראי של amoebiasis האנושי, דלקת מעיים וגורם לדלקת ושלשולים. E. histolytica מדביק עד 50 מיליון אנשים מדי שנה, אך רק כ -10% מאנשים נגועים לפתח סימפטומים הקשורים לamoebiasis 1. הדבקה מתרחשת על בליעה של מזון מזוהם או מים המכילים E. ציסטות histolytica. במעי, ציסטות לייצר trophozoites לחיות כי לדבוק mucin המעי הגס ולהתרבות 2. Trophozoites בדרך כלל בצורת ציסטות שמופרשות דרך צואה. במקרים אחרים, ומסיבות שעדיין לא ידועות, trophozoites לשבור את שכבת האפיתל במעי ולפלוש לרקמות הבסיסיות. במקרים הגרועים ביותר, הם נכנסים לזרם הדם ומשפיעים על איברים אחרים כגון הכבד 3.
שבירת מחסום אפיתל דורשת שיבוש של מבני transmembranal אפיתל, כי לשמור על תאים הצטרפו. תאי אפיתלקשרים נוצרים על ידי מורכב junctional פסגת המורכב ההדוק (TJ) וadherens צמתים (AJ), ודסמוזומים 4. צמתים apical ביותר הם TJ, ולכן, הם המכשול הראשון עלב ידי א histolytica וכמה פתוגנים אחרים בזמן פלישה מארחת. TJ מורכב מקולטנים הידבקות transmembranal כגון claudins, occludin ומולקולות junctional הידבקות (JAM) העוסקים בהומו או אינטראקציות heterophilic עם הקולטנים של התא השכן. הם מחויבים intracellularly ידי מולקולות פיגום של occludens zonula משפחה (ההסתדרות הציונית) המתחברים לקולטנים הידבקות cytoskeleton אקטין לספק חוזק מכאני נוסף לאפיתל. TJ אחראי לאיטום רקמת מעי מלומן המעיים, מניעת מים מוגזמים וזליגה מומסת. כך, לאחר TJ הם שיבשו על ידי טפיל, רקמות פלשו. E. histolytica מפריש כמה מולקולות כגון: (i) המעורבים בהידבקות של אמבות לטארגתאי et 5; (Ii) גורמי קרום פעיל משתתפים בהרג של תאי מארח ידי exocytosis, למשל פפטידים יוצרי ערוץ יון כינה amoebapores 6,7; וכן (iii) proteinases שבזות חלבוני מטריצת חוץ תאיים ולתווך 5,8,9 התפוררות רקמה.
פרוטאז ציסטאין EhCP112 ומולקולת הידבקות EhADH112 שיחד יוצר קומפלקס EhCPADH112 שני E. histolytica ארסיות חלבונים שממלאים תפקיד מרכזי בפירוק של TJ 10. trophozoites בשידור חי, lysates הכולל שלהם ומוצרים מופרשים לגרום לשינויים מולקולריים בהפרעה המורכבת ופונקציונלית של TJ מחסום האפיתל. במחקר זה, הוא הראה כי EhCP112 וEhADH112 אינטראקציה עם occludin וחלבונים claudin-1 שמוביל להפנמה ופירוק של חלבוני תא, ובכך להקל E. כניסת histolytica דרך מסלול paracellular.
נתונים אלה וo שלנוו קבוצות אחרות 11-17 ממליץ בחום שיש הצורך באינטראקציות בין מאכסן לפתוגן ספציפיים המאפשרות פלישת הטפיל. להתיר את הבסיס המולקולרי של אינטראקציות אלה הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של הפתוגנזה amoebiasis. הפרעה סלקטיבית של TJ ידי trophozoites, מאופיין בחדירות paracellular מוגברות, ניתן למדוד על ידי ירידה בהתנגדות חשמלית transepithelial (TER). ההעברה של חלבונים טפילים כלפי epithelia מארח יכולה להיקבע על ידי מכתים immunofluorescence ומיקרוסקופ לייזר confocal, שיטה שיכולה גם לחשוף את שיתוף הלוקליזציה של גורמים ארסי אמבה עם סמני junctional האפיתל המצביעים על יחסי גומלין ישירים אפשריים. במאמר זה, אנו מתארים בפירוט כיצד תאי אפיתל וtrophozoites מעובדות, שנקטפו ומניפולציות כדי לבחון אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן והשלכות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת ללמוד באינטראקציות בין המאכסן לפתוגן מבחנה במהלך זיהום האפיתל על ידי א histolytica, חשוב לעבוד עם תרבויות מבוססות היטב של שני תאים וtrophozoites אפיתל. לדוגמא, בעבר, א תרבויות histolytica היו בדרך כלל הוקמו בשיתוף עם מינים מסוימים של חיידקים או trypanosomatids …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
