Análise do dano epitelial Produzido pela<em> Entamoeba histolytica</em> Infecção
Summary
A infecção humana por Entamoeba histolytica leva a amebíase, uma das principais causas de diarréia em países tropicais. A infecção é iniciada pelo agente patogénico com as células epiteliais do intestino, provocando a abertura dos contactos célula-célula e, consequentemente, a diarreia, por vezes, seguido por uma infecção do fígado. Este artigo fornece um modelo para avaliar as interações patógeno-hospedeiro iniciais para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese.
Abstract
Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase humana, uma das principais causas de diarréia e abscesso hepático em países tropicais. A infecção inicia-se por interacção do agente patogénico com células epiteliais intestinais. Essa interação leva à ruptura das estruturas intercelulares, como junções apertadas (TJ). TJ garantir a vedação da camada epitelial para separar tecido hospedeiro do lúmen intestinal. Estudos recentes fornecem evidências de que a interrupção do TJ pelo EhCPADH112 proteína parasitária é um pré-requisito para E. invasão histolytica que é acompanhada por disfunção da barreira epitelial. Assim, a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na TJ desmontagem durante E. invasão histolytica é de suma importância para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese. Este artigo apresenta um modelo simples que permite a avaliação das interações iniciais patógeno-hospedeiro eo potencial de invasão do parasita. Os parâmetros a serem analisados incluem tresistência eléctrica ransepithelial, interacção de EhCPADH112 com receptores da superfície do epitélio, as alterações na expressão e localização de marcadores epiteliais juncionais e localização das moléculas do parasita no interior das células epiteliais.
Introduction
Entamoeba histolytica é um protozoário única célula responsável da amebíase humano, uma infecção intestinal causando inflamação e diarréia. E. histolytica infecta até 50 milhões de pessoas por ano, mas apenas cerca de 10% das pessoas infectadas desenvolvem os sintomas associados a amebíase 1. A infecção ocorre após a ingestão de alimentos contaminados ou água contendo E. cistos histolytica. No intestino, os cistos produzir trofozoítos vivos que aderem a mucina do cólon e proliferam 2. Trofozoítos geralmente formam cistos que são excretados via fezes. Em outros casos, e por razões ainda desconhecidas, trofozoítos quebrar a camada epitelial intestinal e invadir os tecidos subjacentes. No pior dos casos, eles entram na corrente sanguínea e afetar outros órgãos como o fígado 3.
Quebrando a barreira epitelial requer rompimento de estruturas epiteliais transmembranares que mantêm as células unidas. Célula epitelialos contactos são formados pelo complexo de junções de apicais consistindo apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ), e 4 desmossomas. As junções mais apicais são TJ e, por isso, eles são a primeira barreira afrontado por E. histolytica e alguns outros agentes patogénicos durante a invasão de host. TJ são compostos de receptores de adesão transmembranares como claudinas, occludin e moléculas de adesão juncional (JAM) que se envolvem em interações heterofílicos homo ou com os receptores da célula vizinha. Eles são intracelularmente ligados por moléculas de andaime dos occludens zonula (ZO) da família de receptores de adesão que se ligam ao citoesqueleto de actina para proporcionar mais resistência mecânica ao epitélio. TJ são responsáveis pela vedação do tecido intestinal do lúmen intestinal, evitando excesso de água e vazamento de soluto. Assim, depois de TJ são interrompidos pelo parasita, os tecidos são invadidos. E. histolytica segrega várias moléculas, tais como: (i) aqueles que estão envolvidos na adesão de amebas para alvet células 5; (Ii) fatores de membrana ativa participação em morte de células hospedeiras por exocitose, por exemplo, os peptídeos que formam os canais de íon denominado amebaporos 6,7; e (iii) as proteinases que degradam as proteínas da matriz extracelular e tecido mediam desintegração 5,8,9.
A protease de cisteína EhCP112 e a molécula de adesão EhADH112 que em conjunto formam o complexo EhCPADH112 são dois E. histolytica virulência proteínas que desempenham um papel importante na desmontagem de TJ 10. Trofozoítos vivo, seus lisados totais e produtos secretados induzir alterações moleculares no TJ distúrbio complexo e funcional da barreira epitelial. Neste estudo, demonstra-se que EhCP112 e EhADH112 interagir com ocludina e claudina-1 de proteínas que conduzem à internalização e a degradação das proteínas celulares, facilitando, assim, E. entrada histolytica através da via paracelular.
Os dados e os óf outros grupos 11-17 sugerem fortemente a necessidade de interações patógeno-hospedeiro específicas que permitem a invasão do parasita. Desvendando as bases moleculares destas interações é de extrema importância para uma melhor compreensão da patogênese amebíase. Perturbação selectiva dos TJ por trofozoítos, caracterizado pelo aumento da permeabilidade paracelular, pode ser medido por uma diminuição da resistência eléctrica transepitelial (TER). A transferência de proteínas de parasitas no sentido epitélios host podem ser determinada por imunofluorescência e por microscopia confocal a laser, um método que também pode revelar a co-localização de factores de virulência ameba com marcadores juncionais epiteliais indicando possíveis interacções directas. Neste artigo, vamos descrever em detalhes como células epiteliais e trofozoítos são cultivadas, colhidas e manipuladas para examinar as interações patógeno-hospedeiro e suas consequências.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para o estudo in vitro interações patógeno-hospedeiro durante a infecção epitelial pelo E. histolytica, é fundamental para trabalhar com culturas bem estabelecidas de ambas as células epiteliais e trofozoítos. Por exemplo, antigamente, E. culturas histolytica geralmente tinha sido estabelecida em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos 22,23. No entanto, a co-cultura de E. culturas histolytica é contraproducente para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
