Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

Adhesión de los linfocitos T es un proceso fundamental en la respuesta inmune ^1. Se requiere para la interacción de células T con células endoteliales decoración de las paredes de los capilares, para el antígeno de células presentadoras de barrido (APC) dentro de los ganglios linfáticos, y para la formación de sinapsis inmunológica (IS) con las células diana ^2. Estos requisitos son funcionalmente y cinéticamente distintas. El proceso de la extravasación de linfocitos consiste quimioatracción, laminados, la adhesión firme y la transmigración. La transición de la rueda a la adhesión firme requiere que las células T para responder a una señal de receptor acoplado a proteína G rápidamente. Esta respuesta se obtiene una interacción ligando integrina que ralentiza y detiene la célula de rodaje ^3. Un cambio inmediato en la avidez de la integrina medie este proceso. La migración requiere interacciones betweenTcells dinámicas y las células endoteliales con la formación de adherencias en el 'front-end' y la rotura de adherencias en la "parte trasera"con un intervalo de aproximadamente un minuto entre la formación y la ruptura ^4. El IS forma inminutes, pero debe permanecer intacto durante horas ^6.

Curiosamente, una molécula de adhesión, la función de los linfocitos miembro de la familia de integrinas antígeno asociado (LFA) – 1, es esencial para todos estos procesos ^5. LFA-1 media la adhesión a través de interacciones con varios miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. El ligando más ampliamente estudiado con la mayor afinidad a la LFA-1 es la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1. Linfocitos circulantes no activadas expresan baja afinidad de LFA-1 en la superficie celular, y por lo tanto son incapaces de adherirse a la ICAM-1 recubiertos superficies. LFA-1 afinidad es variable y regulada por varios eventos de señalización tales como la activación de la proteína G de receptores acoplados, la estimulación de citoquinas, y las señales mediadas por receptores de células T (TCR). La forma de alta afinidad resultante de la LFA-1 transmite la activación intracelular al espacio extracelular tediante interacciones con la ICAM-1. Esta vía se denomina dentro-fuera de señalización ^7. Del mismo modo, la señalización a través de LFA-1 desde el espacio extracelular se llama fuera-en la señalización.

La cascadas de señalización intracelular que participan en el interior-y exterior-en la señalización son un foco importante de la investigación actual. La pequeña GTPasa Rap1 ha surgido recientemente como el componente clave de dentro a fuera de señalización que es común tanto a la ligadura de TCR y la señalización de citoquinas ^8. El papel crítico de Rap1 en activación de la integrina se pone de relieve por el descubrimiento de que la sobreexpresión de Rap1 estimula la adhesión dependiente de integrina de las células T, mientras que la adhesión de células T está bloqueada por la expresión de dominante negativo Rap1 ^9. Estos avances en nuestra comprensión de la regulación de la integrina por Rap1 han llevado a cabo utilizando herramientas vitro. Entre ellos se encuentra el ensayo de adhesión estática se describe aquí.

El objetivo general de este método es el estudio de Tadhesividad de células a la ICAM-1 las superficies recubiertas. Más específicamente, se utiliza para medir y cuantificar objetivamente la LFA-1 afinidad hacia sus ligandos contador en células vivas en tiempo real, bajo diferentes condiciones. Esta técnica utiliza pocillos de poliestireno recubiertas con ICAM-1 para imitar las superficies celulares que las células T interaccionan con. Muchos ensayos de adhesión de células T estáticos descritos anteriormente fueron experimentalmente complejo. Estos ensayos a menudo necesarios para las células T que se marcaron radiactivamente, utilizan células corneales bovinas cultivadas para crear una matriz extracelular como el sustrato para la adhesión de las células T, o llamados para no fisiológica estimulación de células T durante una duración prolongada para promover la adhesión de células T ^10. El uso de la medición fluorométrica para cuantificar las células T después de la incubación de adherencia es un método más sensible y precisa de la cuantificación en comparación con la citometría de flujo y microscopía, como se utilizan en muchos otros sistemas de ensayo ^11. Además, solo microscópicas de célulasIC análisis de la localización de la integrina no permite el análisis amplio, la población basada en la misma forma que la medición fluorométrica. Mientras que la activación de LFA-1 anticuerpos específicos de cada estado están disponibles comercialmente, estos anticuerpos ofrecen baja sensibilidad en relación con el método descrito aquí. La principal ventaja sobre las técnicas alternativas es su simplicidad y la capacidad de examinar múltiples condiciones experimentales simultáneamente. Al considerar este método para una aplicación específica, se debe tener en cuenta que las células T deben ser seleccionados negativamente, recién aisladas, y se etiquetan con un marcador fluorescente.