סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים
Summary
assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שוטף סדרתי.
Abstract
הידבקות הלימפוציטים T נדרש עבור פונקציות מרובות תא T, כולל הגירה לאתרים של דלקת והיווצרות של סינפסות החיסונית עם תאי המציגים אנטיגנים. תאי T להשיג הידבקות מוסדרת על ידי שליטה על מאפייני ההדבקה של integrins, ברמה של מולקולות הידבקות תא מורכבות מזוגות heterodimeric של חלבונים הטרנסממברני כי אינטראקציה עם מולקולות מטרה בתאי שותף או מטריקס. Integrin תא T הבולט ביותר היא פונקצית הלימפוציטים אנטיגן קשור (LFA) -1, שהורכב מיחידות המשנה αL וβ2, היעד שלו היא המולקולה תאית ההידבקות (ICAM) -1. יכולתו של תא T כדי לשלוט בהדבקה נובעת מהיכולת לווסת מצבי הזיקה של integrins בודדת. איתות מבפנים החוצה מתארת את התהליך שבו אותות בתוך תא יגרמו לתחומים החיצוניים של integrins להניח מצב מופעל. הרבה מהידע של תופעות מורכבות אלה שלנו מבוסס על מכניסטיתמחקרים שבוצעו בפשוט במערכות מודל חוץ גופית. Assay הידבקות הלימפוציטים T שתואר כאן הוא כלי מצוין שמאפשר לתאי T לדבוק ביעד מולקולות, בתנאים סטטיים, ולאחר מכן משתמש בקורא צלחת ניאון לכמת דביקות. assay זה כבר שימושי בהגדרת חומרי הדבקת גירוי או מעכבת הפועלים על לימפוציטים, כמו גם המאפיינים את אירועי האיתות מעורבים. למרות שתואר כאן לLFA-1 – ICAM-1 הידבקות בתיווך; assay זה ניתן להתאים בקלות כדי לאפשר לחקר אינטראקציות אחרות דבק (למשל VLA-4 – פיברונקטין).
Introduction
הידבקות הלימפוציטים T היא תהליך יסודי בתגובה החיסונית 1. היא נדרשת לאינטראקציה תא T עם תאי אנדותל לקשט את קירות נימים, לאנטיגן סריקת הצגת תאים (APC) בבלוטות הלימפה, ולהיווצרות של סינפסות החיסונית (IS) עם תאי המטרה 2. דרישות אלה הן מבחינה פונקציונלית וkinetically מובחן. התהליך של extravasation ימפוציטים מורכב מchemoattraction, הדבקה מתגלגלת, מוצקה, וגלגול. המעבר מהגלגול למיצוק הידבקות דורש תאי T להגיב לאות קולטן מצמידים חלבון G במהירות. תגובה זו מניבה אינטראקציה יגנד integrin שמאטה ומעצרי התא מתגלגל 3. שינוי מיידי בלהיטות integrin מתווך את התהליך הזה. הגירה דורשת betweenTcells אינטראקציות דינמית ותאי האנדותל עם היווצרות של הידבקויות ב'הקדמי 'ושבירה של הידבקויות ב'האחורי'עם מרווח של כדקה בין יוצרים ושבירת 4. הוא צורות inminutes, אבל צריך להישאר ללא פגע במשך שעות 6.
מעניין לציין, כי מולקולת הידבקות אחד, פונקצית משפחת integrin הלימפוציטים חבר אנטיגן קשור (LFA) – 1, היא חיונית לכל התהליכים הללו 5. LFA-1 מתווך הידבקות דרך אינטראקציות עם כמה מחברי superfamily אימונוגלובולינים. ליגנד למד נרחב ביותר בזיקה הגבוהה ביותר לLFA-1 הוא מולקולת ההידבקות אינטר (ICAM) -1. ללא הפעילו לימפוציטים במחזור להביע את הזיקה נמוכה LFA-1 על פני התא, ולכן אינם מסוגל לדבוק מצופה ICAM-1-משטחים. זיקת LFA-1 היא משתנה ומוסדר על ידי מספר אירועי איתות כגון הפעלת חלבון G בשילוב קולטן, גירוי ציטוקינים, ואותות מתווכים על ידי קולטנים תא T (TCR). צורת זיקה גבוהה וכתוצאה מכך של LFA-1 מעביר הפעלה תאית למרחב תאי לאאינטראקציות hrough עם ICAM-1. מסלול זה נקרא מבפנים החוצה איתות 7. כמו כן, איתות דרך LFA-1 מהמרחב תאי נקראת מחוץ-באיתות.
איתות תאית מפלים מעורבים במבפנים החוצה ומחוץ-איתות הוא מוקד עיקרי של מחקר הנוכחי. GTPase Rap1 הקטן התפתחה לאחרונה כמרכיב המרכזי של מבפנים החוצה מאותת כי משותף לשתי קשירת TCR וציטוקינים איתות 8. התפקיד הקריטי של Rap1 בהפעלת integrin מודגש על ידי הגילוי כי ביטוי יתר של Rap1 מגרה הידבקות integrin תלויה בתאי T, ואילו הדבקת תא T חסומה על ידי ביטוי של Rap1 השלילי הדומיננטי 9. מקדמות אלה בהבנה של הרגולציה integrin ידי Rap1 שלנו היו להשיג באמצעות כלים במבחנה. אחד מהם הוא assay ההידבקות סטטית שתואר כאן.
המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד Tדביקות תא לICAM-1 משטחים מצופים. באופן ספציפי יותר, הוא משמש כדי למדוד באופן אובייקטיבי ולכמת זיקת LFA-1 לכיוון ligands הנגד שלה בתאים חיים בזמן אמת, בתנאים שונים. טכניקה זו משתמשת בארות קלקר מצופים ICAM-1 כדי לחקות את המשטחים התאיים שתאי T אינטראקציה עם. מבחני הידבקות תא T סטטי שתוארו קודם לכן רבים מהם היו בניסוי מורכבים. מבחני אלה לעתים קרובות נדרשים לתאי T שכותרתו רדיואקטיבית, מנוצלים תאים קרני שור בתרבית כדי ליצור מטריצה תאית כמצע להידבקות תא T, או שנקראים לגירוי תאים לא פיסיולוגי T על הארכת משך לקדם הידבקות תא T 10. השימוש במדידת fluorometric לכמת תאי T הבאים הדגירה ההידבקות היא שיטה רגישה יותר ומדויקת של כימות בהשוואה לזרימת cytometry ומיקרוסקופיה, כמנוצלים במערכות רבות assay אחרים 11. בנוסף, microscop תא בודדניתוח ic של לוקליזציה integrin אינו מאפשר ניתוח באותו אופן כמו מדידת fluorometric הרחב, האוכלוסייה מבוססת. בעוד נוגדני מדינה ספציפית הפעלת LFA-1 זמינים באופן מסחרי, נוגדנים אלה מציעים רגישות נמוכה יחסית לשיטה שתוארה כאן. היתרון העיקרי על פני שיטות חלופיות הוא בפשטותו והיכולת לבחון תנאי ניסוי מרובים בו זמנית. כאשר שוקלים בשיטה זו עבור יישום מסוים, יש לקחת בחשבון שתאי T צריכים להיות נבחרו באופן שלילי, מבודדים טרי, ושסומנו בסמן פלואורסצנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר מבחני כדי ללמוד אותות להפעלת LFA-1 והידבקות תא T 12. Cytometry זרימה משמשת למדידת מדינות זיקה LFA-1 בתאים חיים באמצעות נוגדנים חד שבטיים אשר נקלטות באופן סלקטיבי לאו bended או מורחב LFA-1. אחת המגבלות של שיטה זו היא שהיא אינה לוקחת בחשבון הלהיטות 'integrins. מבחני הגירה ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil אמון, מייקל חוקרי קרנות מחקר רפואי ספירשטיין, והמלגה באוניברסיטת ניו יורק וייטהד תמכו עבודה זו.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
