Statique Essai d'adhésion pour l'étude de l'intégrine activation dans les lymphocytes T

L'adhérence des lymphocytes T est un processus fondamental dans la réponse immunitaire ^1. Il est nécessaire pour l'interaction des lymphocytes T avec les cellules endothéliales décorer les parois capillaires, pour l'antigène des cellules présentatrices de balayage (APC) à l'intérieur des ganglions lymphatiques, et pour la formation de synapses immunologiques (IS) avec des cellules cibles ^2. Ces exigences sont fonctionnellement distincte et cinétique. Le processus de lymphocytes extravasation se compose de la chimio-attraction, roulement, adhérence ferme et la transmigration. La transition de roulement pour raffermir l'adhérence des lymphocytes T nécessite de répondre à un signal de récepteur couplé à la protéine G rapidement. Cette réponse donne une interaction ligand des intégrines qui ralentit et arrête la cellule de roulement ^3. Un changement immédiat dans avidité intégrine médiatise ce processus. Migration nécessite interactions betweenTcells dynamiques et les cellules endothéliales avec la formation d'adhérences à l'extrémité avant »et la rupture des adhérences à l'extrémité arrière 'avec un intervalle d'environ une minute entre la formation et la rupture ^4. L'IS forme inminutes, mais doit rester intact pendant des heures ^6.

Fait intéressant, une molécule d'adhérence, la fonction des lymphocytes membre de la famille des intégrines antigène associé (LFA) – 1, est essentiel pour tous ces processus ^5. LFA-1 médie l'adhésion grâce à des interactions avec plusieurs membres de la superfamille des immunoglobulines. Le ligand le plus largement étudié avec la plus forte affinité pour le LFA-1 est la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1. Lymphocytes circulants non activés expriment une faible affinité de LFA-1 sur la surface cellulaire, et par conséquent ne peuvent pas adhérer à des surfaces ICAM-1-enduit. LFA-1, l'affinité est variable et régulée par plusieurs événements de signalisation telles que la protéine G couplée activation du récepteur, la stimulation de cytokines, et des signaux médiés par des récepteurs de cellules T (TCR). L'forme de haute affinité résultant de LFA-1 transmet activation intracellulaire vers l'espace extracellulaire trâce interactions avec ICAM-1. Cette voie est appelée inside-out signalisation ^7. De même, la signalisation par LFA-1 de l'espace extracellulaire est appelé en dehors dans la signalisation.

Le intracellulaire cascades impliqués dans l'envers et à l'extérieur dans la signalisation de signalisation sont un axe majeur de la recherche actuelle. La petite GTPase Rap1 a récemment émergé comme l'élément clé de l'intérieur-out signalisation qui est commun aux deux ligature TCR et de signalisation ⁸ cytokine. Le rôle essentiel des Rap1 dans l'activation des intégrines est mis en évidence par la découverte que la surexpression de Rap1 stimule l'adhérence de l'intégrine-dépendant des cellules T, tandis que l'adhésion des cellules T est bloqué par l'expression d'Rap1 dominant négatif ^9. Ces avancées dans notre compréhension de la régulation de l'intégrine par Rap1 ont été réalisées en utilisant des outils in vitro. Parmi eux se trouve l'analyse de l'adhérence statique décrit ici.

L'objectif global de cette méthode est d'étudier Tcellule adhérence à ICAM-1 des surfaces revêtues. Plus précisément, il est utilisé pour mesurer objectivement et quantifier l'affinité de LFA-1 vers ses homologues de ligands dans les cellules vivantes au temps réel, dans différentes conditions. Cette technique utilise des puits de polystyrène revêtus d'ICAM-1 pour imiter les surfaces cellulaires que les cellules T interagissent avec. De nombreux tests d'adhésion sur les cellules T ont été décrites précédemment statique expérimentalement complexe. Ces dosages souvent requis pour les cellules T à être marquées de façon radioactive, utilisés cellules cornéennes bovines en culture pour créer une matrice extracellulaire comme substrat pour T adhésion cellulaire, ou appelé à la stimulation des cellules T non-physiologique pendant une durée prolongée, de promouvoir T adhésion cellulaire ^10. L'utilisation de la mesure fluorométrique pour quantifier les lymphocytes T suite à l'incubation de l'adhérence est une méthode plus sensible et précise de la quantification par rapport à la cytométrie en flux et la microscopie, qui sont utilisés dans de nombreux autres systèmes de dosage ^11. En outre, par microscopie de cellule uniqueic analyse de l'intégrine localisation ne permet pas de la large population sur la base de l'analyse de la même manière que la mesure fluorométrique. Alors que l'activation de LFA-1 anticorps spécifiques de l'Etat sont disponibles dans le commerce, ces anticorps offrent une faible sensibilité par rapport à la méthode décrite ici. Le principal avantage par rapport aux techniques alternatives est sa simplicité et la possibilité d'examiner de multiples conditions expérimentales simultanément. Lors de l'examen de cette méthode pour une application spécifique, il faut prendre en compte que les cellules T doivent être sélectionnés négativement, fraîchement isolées, et marqué avec un marqueur fluorescent.