Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

Tリンパ球の接着は、免疫応答^1と基本的な処理である。これは、標的細胞に²リンパ節内の細胞（APC）に抗原提示を走査するため、および免疫学的シナプスの形成のために、内皮細胞が毛細血管壁を装飾するとT細胞の相互作用のために（IS）が必要である。これらの要件は、機能的にも速度論的に区別される。リンパ球の血管外漏出のプロセスは、化学誘引、ローリング、強固な接着、移住から構成されています。接着を会社にローリングからの移行が急速にGタンパク質共役受容体シグナルに応答するT細胞を必要とします。この応答は、細胞ローリング^3を遅くし、逮捕インテグリンリガンド相互作用が得られます。インテグリン結合活性の即時の変化は、このプロセスを仲介する。移行は「フロントエンド」と「後端」の癒着の破損で癒着の形成と動的な相互作用のbetweenTcellsおよび内皮細胞を必要とする形成し^、4を壊す約分間隔で。 ISはinminutesを形成するが、時間⁶用にそのまま残る必要があります。

興味深いことに、ある接着分子、インテグリンファミリーメンバーリンパ球機能関連抗原（LFA） -図1は、これら全ての方法⁵に必須である。 LFA-1は、免疫グロブリンスーパ​​ーファミリーのいくつかのメンバーとの相互作用を介して接着を媒介する。 LFA-1の最も高い親和性を有する最も広く研究リガンドは、細胞間接着分子（ICAM）-1である。非活性循環リンパ球は、細胞表面上に低親和性LFA-1を発現し、従って、ICAM-1でコーティングされた表面に付着することができない。 LFA-1の親和性は、可変ならびにT細胞受容体（TCR）によって媒介されるGタンパク質共役受容体の活性化、サイトカイン刺激、および信号などのいくつかのシグナル伝達事象によって調節される。LFA-1が得られた高親和性形態は、細胞外空間への細胞内活性化を搬送するTICAM-1との相互作用hrough。この経路は^{、7シグナリング}インサイドアウトと呼ばれている。同様に、細胞外の空間から、LFA-1を介したシグナル伝達は、アウトサイド·インのシグナリングと呼ばれています。

インサイドアウトやアウトサイドインシグナル伝達に関与カスケードの細胞内シグナル伝達は、現在の研究の主要な焦点である。低分子量GTPase Rap1のは、最近、それは、TCRライゲーションおよび⁸サイトカイン^シグナルの両方に共通しているシグナルインサイドアウトの重要な要素として浮上している。インテグリン活性化のRap1の重要な役割は、T細胞の接着が、ドミナントネガティブ型Rap1 ⁹の発現によって遮断される一方のRap1の過剰発現は、T細胞のインテグリン依存性接着を刺激するという発見により強調される。 Rap1のによるインテグリン規制の我々の理解におけるこれらの進歩は、in vitroのツールで使用して達成されてきた。これらの中でも、ここで説明した静的接着アッセイである。

この方法の全体的な目標は、Tを研究することであるICAM-1をコーティングした表面への細胞接着。具体的には、客観的に測定し、異なる条件下で、リアルタイムで生細胞におけるそのカウンターリガンドに向かってLFA-1の親和性を定量するために使用される。この技術は、T細胞と相互作用する細胞の表面を模倣するようにICAM-1でコーティングしたポリスチレンウェルを使用する。多くの前述の静的T細胞接着アッセイは、実験的に複雑であった。これらのアッセイは、しばしば、培養されたウシ角膜細胞は、T細胞の接着のための基質として細胞外マトリックスを作成するために利用される放射性標識するT細胞に必要な、またはT細胞の接着^10を促進するために拡張された期間にわたって非生理学的T細胞刺激を求めた。多くの他のアッセイシステム¹¹で利用されるように、フローサイトメトリーおよび顕微鏡流れと比較して、接着インキュベーション後のT細胞を定量するための蛍光測定の使用は、定量化のより高感度かつ正確な方法である。さらに、単一細胞microscopインテグリン局在のIC分析では、蛍光の測定と同様に広範な、人口ベースの分析のために許可していません。活性化状態特異LFA-1抗体が市販されているが、これらの抗体は、ここで説明する方法に比べて低い感度を提供します。代替技術上の主な利点は、その単純さと、同時に複数の実験条件を確認できることが挙げられます。特定のアプリケーションのためにこの方法を検討する場合、一方はT細胞が負に、選択された新たに単離され、蛍光マーカーで標識されるべきであることを考慮すべきである。