El uso de<em> Flexneri Shigella</em> Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

1. Monitoreo autofagia y el citoesqueleto in vitro utilizando células de tejido Cultura Preparar S. flexneri Placa S. flexneri M90T (de tipo salvaje) de -80 ° C en glicerol en un Rojo Congo caseína de soja tríptico (TCS) placa de agar. Incubar toda la noche a 37 ° C. La misma placa se puede utilizar para varios experimentos. Escoja una colonia individual y crecer en 8 ml de medio de TCS en un agitador durante la noche a 37 ° C. NOTA: unión Congo-rojo indica que el plásmido de virulencia se ha mantenido. Para subcultura bacterias de crecimiento exponencial, inocular TCS fresco con el cultivo bacteriano durante la noche a 1/80 de dilución y crecer en un agitador a 37 ° C a OD 600 = 0,3-0,6. Gira la subcultura bacteriana a 1.000 xg durante 5 min. Lavar el sedimento con MEM y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min. Reconstituir el precipitado en MEM a OD 600 = 0,3-0,6. Preparar HeLa CeLLS para la infección Se cultivan las células HeLa en "medio completo", es decir., MEM más L-alanil-L-glutamina suplementado con piruvato de sodio 1 mM, solución de aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y 10% de suero de ternera fetal. Placa 1-1,5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos 24 o 48 horas antes de comenzar el experimento. Placa en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos para microscopia, o placa en placas de 35 mm de fondo de vidrio para prepararse para imágenes en vivo. NOTA: (por ejemplo., Colas de actina, jaulas septina) para seguir la autofagia (por ejemplo, Atg8 / LC3 + ve autofagosomas) y citoesqueleto dinámica en tiempo real, durante la infección por Shigella utilizando imágenes en vivo, las células de cultivo de tejidos pueden ser transfectadas transitoriamente utilizando las buenas prácticas agrarias, RFP- o construcciones CFP-etiquetadas (ver Discusión). Infección Infectar las células con 100: 1 multiplicidad de infección (MOI) de Shigella (OD 600 = desde 0,3 hasta 0,6) diluido en MEM; añadir directamente a las células HeLa chapados en 6-wplacas ell 24 – 48 h antes de la infección (como se describe en la sección 1.2) en 2 ml de MEM (suero de hambre). Para maximizar la adherencia bacteriana a las células huésped, bacterias y células de centrifugación a 700 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se incuba durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y permitir la infección de proceder. Lavar las células dos veces con MEM infectadas fresco y se incuba con gentamicina que contienen medio completo (50 g / ml, para eliminar las bacterias extracelulares) durante 1-4 hr dependiendo del experimento. Fijación y Etiquetado de las células HeLa infectadas para Microscopía Lavar las células infectadas dos veces con PBS 1x, y fijar durante 15 minutos en 4% de paraformaldehído en PBS 1x a temperatura ambiente. Para quitar paraformaldehído, células de lavado 2 veces con 1 × PBS. Se incuban las células fijas en cloruro de amonio 50 mM durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS 1x, y permeabilizar las células durante 4 minutos con 0,1% de condensados ​​de óxido de etileno octilfenol en la sala de temperatura. NOTA: Alternativas a Octilfenol condensado de óxido de etileno para la permeabilización, tales como saponina o metanol, se pueden aplicar para diferentes preservación de las estructuras celulares 20. Lavar las células en 1x PBS y se incuban en cámara húmeda con anticuerpos primarios contra los componentes críticos autofagia (por ejemplo, p62 / SQSTM1) o el citoesqueleto de septinas (sept2, SEPT6, SEPT7, SEPT9, y sept11 se expresan en células HeLa) durante 30 min (a temperatura ambiente) a la noche (a 4 ° C). Lavar las células dos veces con 1x PBS y se incuban en cámara húmeda con anticuerpos secundarios, y la etiqueta de actina filamentosa (F-actina) con faloidina, durante 30 minutos (a temperatura ambiente) para durante la noche (a 4 ° C). Para la tinción de los núcleos celulares de acogida añaden 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Lavar las células en PBS 1x y montar los cubreobjetos de vidrio en las diapositivas utilizando medio de montaje. Imágenes microscópicas de las células HeLa infectadas Para la imagen de la infejadas células utilizan un microscopio confocal de epifluorescencia o un objetivo de 63X y 100X para identificar o marcado con DAPI Shigella. NOTA: Como se muestra en las figuras 1A – 1C, jaulas septina se pueden visualizar como anillo como las estructuras, ~ 0,6 m de diámetro, que rodea las bacterias citosólicas polimerización de la actina y la contratación de los marcadores de autofagia (por ejemplo, p62 y LC3) 7,8. Por el contrario, las bacterias polimerización colas de actina no serán compartimentados por jaulas septina y no serán dirigidos a la autofagia 7,8. El uso de un microscopio confocal de epifluorescencia o un objetivo de 63X y 100X o, cuantificar el número de bacterias intracelulares por campo microscópico. También cuantificar el número de bacterias atrapadas en jaulas septina y específicas para la autofagia, o polimerización colas de actina y que escapan autofagia. Para determinar el porcentaje de bacterias atrapadas en jaulas septina o polimerización colas de actina, tomar una serie de imágenes Z-pila de infected células, el proceso de las imágenes y contar al menos 500-1.000 bacterias por experimento de al menos 3 experimentos independientes. 2. Análisis Funcional de autofagia y el citoesqueleto In Vitro NOTA: Tanto la genética y enfoques farmacológicos pueden ser utilizados para perturbar la autofagia en las células de cultivo de tejidos infectados, y el impacto de estos tratamientos en el curso de la infección puede ser monitoreado. siRNA mediada por silenciamiento Placa 0,8 x 10 5 células HeLa en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos en medio completo. Transfectar el día siguiente utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos con siRNA contra la autofagia y / o marcadores del citoesqueleto. Después del período de incubación, infectar a las células con Shigella como se describe en la sección 1.3. Fijar y marcar las células como se describe en la sección 1.4. La manipulación farmacológica <br /> NOTA: El citoesqueleto se puede manipular farmacológicamente, por ejemplo, para despolimerizar el uso citoesqueleto de actina citocalasina D o latrunculin B, para despolimerizar los microtúbulos nocodazol utilizan, para bloquear la actividad de actomiosina uso blebbistatin, o para interrumpir septinas uso conjunto de forchlorfeneuron. La autofagia puede ser estimulado mediante el uso de rapamicina o bloqueado por el uso de bafilomicina. Para manipular el citoesqueleto durante la infección por Shigella, primero infectar las células con Shigella como se describe en la sección 1.3 y dar tiempo suficiente para que las bacterias entran en las células y se escapan del fagosoma al citosol (por ejemplo.,> 1,5 infección post hr). Diluir los medicamentos de la solución madre [solución madre suspendidas en dimetilsulfóxido (DMSO)] en el MEM a una concentración final de 5 M (citocalasina D, latrunculin B, nocodazol), 20 M (forchlorfeneuron) o 50 M (blebbistatin), y tratar las células 30 minutos a 37 ° C. La cantidad total de fármaco (volumen del DMSO / dmezcla de alfombra) añadió por placa / vial de células es 5.1 l (dependiendo de la solución madre) por 2 ml de medio. Tratar las células con una dosis similar de DMSO diluido en MEM como un control negativo. Fijar y marcar las células como se describe en la sección 1.4. NOTA: Para la manipulación del flujo de autofagia (en las células infectadas o no infectadas), se extienden de tratamiento de drogas utilizando la rapamicina (20 nM) o bafilomicina (160 nM) de 4 a 12 hr. Western Blot NOTA: autofágicas actividad puede cuantificarse midiendo el nivel de proteína de marcadores autofagia tales como p62 y LC3. Después del período deseado de incubación, recoger y lisar las células para inmunotransferencia. Extractos de proteínas se ejecutan en 8, 10 o 14% de acrilamida geles. Flujo de autofagia, es decir. la tasa de la autofagia, se puede analizar como se describe en 21,22. Imagen microscópica y Cuantificación El uso de un microscopio confocal de epifluorescencia o un objeto de 100X y 63X oive, el efecto de siRNA o tratamiento farmacológico en la infección por Shigella puede ser evaluada por microscopía cuantitativa (es decir, contando de autofagosomas, jaulas septina y colas de actina) como se describe en la sección 1.5 y se muestra en las figuras 2A y 2B. 3. imágenes in vivo de S. flexneri Interacciones con autofagia y el citoesqueleto NOTA: El modelo de pez cebra de la infección por Shigella se puede utilizar para investigar las jaulas septina y autofagia in vivo 19. Preparar S. flexneri Cultura S. flexneri como se describe en la sección 1.1. En OD 600 = 0,3-0,6, vuelta 8 ml subcultivo bacteriano a 1000 xg durante 10 min. Lavar el sedimento con 1x PBS y centrifugar a 1000 xg durante 10 min. Resuspender el precipitado en 80 l de 0,1% de fenol rojo 1x PBS para obtener ~ 2000 bacterias / nl. Mantenga la bactpreparación erial en el hielo para reducir la velocidad de crecimiento. NOTA: La adición de fenol rojo le ayudará a visualizar el inóculo al inyectar en las larvas. Preparar pez cebra larvas para inyección NOTA: El pez cebra se establecen como los huevos y se identifican como los embriones después de la fertilización hasta 72 horas, cuando se les llama larvas. Raza adultos de pez cebra como se describe en Westerfield 23 mediante la colocación de 4 hombres y 8 mujeres (por lo general una proporción de 2: 1) en una pecera independiente con el fondo cubierto de canicas (que evitará que los adultos coman los huevos desovados). Como alternativa, colocar cestos de recolección de huevos dentro de los tanques de cría de la noche anterior. NOTA: Los huevos son fecundados ~ 30 minutos después de las luces se encienden en las instalaciones de pez cebra 23, y deben recogerse lo antes posible para evitar el crecimiento de moho. Cestas de recolección de huevos sirven para recoger los huevos para que puedan ser cosechadas fácilmente y también proteger los huevos de los adultos. Recoger el embrións y les limpiar por lavado en medios embrión (E2) con 0,003% de lejía durante 10 min. Retire E2 con lejía, lavar los embriones 5x en un medio de E2, y hacer crecer los embriones en 10 cm placa de Petri (100 embriones / 50 ml de medio E2) a 28 ° C. Si se utilizan los embriones o larvas para estudios de microscopía, a después de la fecundación 24 hr añadir 0.003% N-feniltiourea al medio de E2 para evitar melanización. Mantener los embriones a los 28 º C para el desarrollo normal. NOTA: las larvas de pez cebra son listas para la infección después de la fecundación en 72 horas. Para los procedimientos de infección y de microscopía, anestesiar larvas de pez cebra en 200 g / ml tricaína en E2. Preparación de pez cebra para larvas intravenosa y la infección local NOTA: Para evaluar la supervivencia del pez cebra durante la infección por Shigella, realizar inyecciones intravenosas caudales. Para visualizar el reclutamiento de marcadores septina y autofagia a Shigella, realice una infección en zonas localizadas como el músculo de la cola. Para una inyección intravenosa caudal, la posición de las larvas anestesiadas lateralmente con el lado dorsal hacia la aguja. Como se muestra en la Figura 3A, coloque la punta de la aguja cerca (posterior) a la abertura urogenital, con el objetivo de la vena caudal, y perforar la piel y suministrar la dosis deseada bacteriana (volumen de inyección 1-5 nl). NOTA: la infección por vía intravenosa es difícil de realizar y tomará varias semanas de entrenamiento para sentirse cómodo con este procedimiento. La inyección de rojo fenol (sin bacterias) para la formación ayudará a evaluar el lugar de la inyección correctamente. NOTA: En el caso de Shigella, dependiente de la dosis experimentos han demostrado que una infección de dosis baja (<1.000 CFU) se borra dentro de 48 h, y una infección de dosis alta (> 4.000 CFU) conduce a la sede de la mortalidad dentro de 48 hr 19. Para una infección del músculo de la cola, colocar las larvas anestesiados como se describe en la sección 3.3.1. Como se muestra en la Figura 3A, coloque el cuidado de la agujaa durante somitas musculares (es decir, segmentos de músculo esquelético) e inyectar un volumen pequeño (es decir., 1 nl) de preparación bacteriana. Inyección intravenosa de bacterias en larvas Tire microcapilares vidrio borosilicato como se describe en el 24. Conectar la aguja al soporte del manipulador manual de grueso tridimensional y romper la punta de la aguja con unas pinzas finas. Para cargar la aguja, coloque una gota de cultivo bacteriano en un cubreobjetos. Encender el cilindro microinyector y gas, ligeramente sumergir la punta de la aguja dentro de la gota, y llenar la aguja con la cantidad deseada de preparación bacteriana. Para calibrar el volumen de inyección, coloque una gota de aceite mineral en una hoja de la cubierta e inyectar la preparación bacteriana. Medir el diámetro de la gota utilizando un micrómetro y calcular el volumen inyectado [V = (4/3) πr 3]. NOTA: El uso de la configuración de inyección de 40 psi y 50 ms con una bacteripreparación al que se describe en la sección 3.1 se dan ~ 2000 UFC / nl. Preparar la placa de inyección utilizando un molde de plástico como se describe en Westerfield 23. Transferir las larvas a la placa de inyección y alinearlos usando un pincel fino. Orient e inyectar las larvas como se describe en la sección 3.3.1. Para la evaluación de la supervivencia de pez cebra, las larvas infectadas transferencia individualmente en placas de 24 pocillos en 1 ml de E2 / pocillo y se incuba a 28 ° C. Monitorear las larvas infectadas al día durante los próximos 2-5 días y la supervivencia parcela con el tiempo (Figura 3B). Plating pez cebra larvas para la cuantificación bacteriana NOTA: Trabaje bajo una campana estéril para evitar la contaminación. Para evaluar el número de bacterias inyectadas en el pescado (después de la infección 0 hr tiempo) y para la cuantificación bacteriana en los puntos de tiempo deseados, sacrificar larvas de pez cebra con una sobredosis de tricaína (200-500 mg / L). Coloque larvas individuales en 1,5 ml poltubo de microcentrífuga ypropylene con 200 l de 0,1% de condensados ​​de óxido de etileno octilfenol 1x PBS y homogeneizar mecánicamente usando una mano de mortero. NOTA: Para confirmar la carga bacteriana en el volumen de inyección, la bomba de una dosis igual en una gota 1x PBS estéril y la placa hacia fuera. Hacer una dilución en serie de los homogeneizados de larvas de pez cebra en agua estéril y placa en caldo de lysogeny (LB) placas de agar. Las larvas pueden ser plateado alternativamente en placas de Rojo Congo TCS para discriminar entre Shigella haber mantenido el plásmido virulento o no. NOTA: La placa 3 o más peces no infectado como control para comprobar el estado de las larvas de pez cebra se utiliza para la infección. Después de la incubación durante la noche de las placas a 37 ° C, contar las colonias bacterianas. Como se muestra en la Figura 3C, representar usando una escala logarítmica. NOTA: La carga bacteriana durante la infección de larvas de pez cebra también se puede visualizar utilizando la etiqueta fluorescente Shigella y yo microscópicaMaging como se describe en la sección 3.7 o 3.8 (Figura 3D). El pez cebra larvas Inmunoticción En los puntos de tiempo deseados, sacrificar las larvas mediante una sobredosis de tricaína. Recoger el pescado en 1,5 ml tubos de microcentrífuga de polipropileno (de 10 a 20 larvas / tubo). Fijar las larvas utilizando paraformaldehído al 4% con 0,4% de condensado de óxido de etileno octilfenol en 1x PBS y se incuban en un agitador orbital (para evitar la agrupación de las larvas) durante 2 horas (a temperatura ambiente) o durante la noche (a 4 ° C). NOTA: La microscopía electrónica se puede utilizar para análisis ultraestructurales de larvas de pez cebra infectada. En este caso, los embriones anestesiados deben ser fijados y procesados ​​de acuerdo con Mostowy et al 19. Lavar 3x en PBS 1x 0,4% condensado de óxido de etileno octilfenol durante 5 min, entonces el bloque en solución de bloqueo (10% de suero bovino fetal, 1% de DMSO, 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán en 1x PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Dilaúd el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Añadir larvas al anticuerpo primario diluido e incubar durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital. Utilice anticuerpos primarios como se describe anteriormente en la sección 1.4.3. Lavar las larvas 4x durante 15 min en 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán 1x PBS a temperatura ambiente. Diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo. Añadir larvas al anticuerpo secundario diluido e incubar durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital. Utilice los mismos anticuerpos secundarios y faloidina como se describe en la sección 1.4.4. Se lava 4x para 15 min en 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán 1x PBS a temperatura ambiente. Para la tinción de núcleos de células anfitrionas añadir DAPI (150 nM concentración final) durante el primero de estos 15 min lavados. Para la conservación de las larvas de marcado con fluorescencia, incubar progresivamente en un gradiente de glicerol de 15, 30, 60, y 80% diluido en PBS 1x y 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán durante 2 horas (en el temperado habitacióntura) para durante la noche (a 4 ° C). NOTA: Stained larvas se puede almacenar durante largos períodos de tiempo en 80% de glicerol a 4 ° C (por ejemplo, 4 meses.). Imagen microscópica de fijo pez cebra larvas Transferencia de las larvas incrustado glicerol fijado a una pequeña gota de 80% de glicerol en una placa de Petri de 35 mm (para microscopía estereoscópica) o un plato de fondo de cristal completa (por miscopy confocal). Tome Z-pila serie de imágenes de las larvas infectadas y procesar las imágenes según sea necesario. Utilice un epifluorescencia o un microscopio confocal y un objetivo de 10X o 20X para la imagen de todo el organismo. A continuación, utilice un microscopio confocal y un objetivo de 40X, 63X o 100X para visualizar las células individuales y la contratación de la autofagia y el citoesqueleto marcadores a bacterias individuales en vivo 19 (Figuras 4A y 4B). NOTA: Infect peces en el músculo de la cola y de montaje en glicerol plana a lo largo de la parte inferior del plato de fondo de vidrio para permitir eaenfoque sy. Vive microscópico de imágenes de Infected pez cebra larvas NOTA: Las larvas son ópticamente accesible, por lo tanto en autofagosomas in vivo pueden ser visualizados usando la línea transgénica pez cebra-GFP Lc3 25. Infectar larvas de pez cebra como se describe en la sección 3.3 y el monte como se describe en esta sección. Preparar bajo punto de fusión al 1% de agarosa (LMA) en E2 y dejar enfriar a 35-37 ° C para evitar daños larvas / asesinato. Distribuir gotas de LMA en una placa de Petri de 35 mm (para microscopía estereoscópica) o un plato con fondo de cristal completa (por microscopía confocal). Transferencia anestesiado larvas de pez cebra individualmente (con tan poca agua como sea posible) a la LMA gotas. Larvas de Oriente a la posición deseada usando un pincel y esperar a que la agarosa se solidifique. Cubra toda la superficie del plato con LMA, y superposición con E2 que contiene 200 mg / ml tricaína para evitar la preparación de la desecación y que los peces puedan intercambiar oxígeno del agua. Utilice un epifluorescencia o un microscopio confocal y un objetivo de 10X o 20X para obtener imágenes de todo el larvas de pez cebra. Utilice un microscopio confocal y un objetivo de 40X, 63X o 100X para visualizar authopagosomes bacterianas (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias-Lc3 + ve vacuolas rodean Shigella) in vivo. Tome un Z-pila de larvas infectadas con el tiempo (por ejemplo., Cada 2 minutos durante varias horas) para visualizar autofagosomas, y su dinámica, en tiempo real. 4. Análisis Funcional de autofagia y el citoesqueleto en Vivo NOTA: El impacto de las perturbaciones farmacológicos y genéticos de la autofagia en el curso de la infección pueden ser monitoreados a nivel de todo el animal, y en el nivel de la célula individual. La autofagia Manipulación por Morpholino Inyección Reconstituir morfolino oligonucleótidos en agua estéril a una solución madre de 1 mM por calentamiento a 65 ° C durante 10 min. Tiendaa temperatura ambiente. NOTA: morfolino inyecciones de oligonucleótidos deben ser realizados en 1-4 embriones en estadio de célula. Preparar la solución de trabajo oligonucleótido morfolino estéril con 0,1% de rojo de fenol en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Cargue la aguja como se indica en el apartado 3.4.2., Morfolino volumen de inyección de oligonucleótido puede ser calibrado como se describe en el apartado 3.4.3. NOTA: El fenol rojo le ayudará a visualizar el volumen inyectado. Prepare una cámara embrión-posicionamiento (es decir., Un portaobjetos de microscopio pegado con cianoacrilato en una placa de Petri de 10 cm con tapa bordes enfrentados la aguja elimina parcialmente). Transferencia de embriones en estadio de 1-4 células a la cámara con una pequeña cantidad de agua y alinearlos con un pincel fino. Penetrar en el corion y la yema de huevo sin problemas. Una vez dentro, pulse el pedal para inyectar el volumen deseado de solución de oligonucleótido morfolino. NOTA: minimizar el volumen de inyección de 0,5 a 2 nl; volúmenes superiores than 5 nl pueden causar defectos en el desarrollo y aumentar la mortalidad de huevos. Después de la microinyección, los embriones limpios (por blanqueo tal como se describe en la sección 3.2) e incubar en una placa de Petri con E2 a 28 ° C. Infectar a las 72 horas de control después de la fertilización (es decir, las larvas de pez cebra inyectados con oligonucleótido morfolino control) o morphants p62 (es decir., Larvas de pez cebra inyectados con oligonucleótido morfolino p62) con Shigella como se describe en la sección 3.4. Evaluar la supervivencia y la carga bacteriana en los próximos 2-5 días como se describe en el apartado 3.5. Imagen fija larvas de pez cebra como se describe en la sección 3.7 y se destaca en la figura 4C, o viva imagen larvas de pez cebra como se describe en la sección 3.8. NOTA: La dosis efectiva oligonucleótido morfolino puede evaluarse en función de su eficacia para inhibir la transcripción de empalme o la traducción de proteínas (ver Discusión).