JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Gebruik van<em> Shigella flexneri</em> Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Published: September 09, 2014
doi:
10.3791/51601
, ,
1Section of Microbiology, MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection,Imperial College London, 2Département de Biologie du Développement et des Cellules Souches,Institut Pasteur, Unité Macrophages et Développement de l’Immunité

Summary

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Abstract

Shigella flexneri is een intracellulaire pathogeen die kan ontsnappen uit phagosomes naar het cytosol te bereiken, en polymeriseren de gastheer actine cytoskelet om haar beweeglijkheid en de verspreiding te bevorderen. New werk heeft aangetoond dat eiwitten betrokken bij actine gebaseerde motiliteit eveneens verbonden met autofagie, een intracellulaire afbraakproces cruciaal voor mobiele autonome immuniteit. Opvallend, kunnen gastheercellen actine gebaseerde beweeglijkheid van S. te voorkomen flexneri door compartimentering van bacteriën in 'Septin kooien' en richten ze naar autofagie. Deze waarnemingen geven aan dat een meer volledig begrip van septins, een familie van draadvormige-GTP-bindende eiwitten, zal nieuwe inzichten verschaffen in het proces van autofagie. Dit rapport beschrijft de protocollen bij autofagie-cytoskelet interacties veroorzaakt door S. bewaken flexneri in vitro middels weefselkweek cellen en in vivo in zebravis larven. Deze protocollen mogelijk onderzoek intracellulaire mechanisms dat bacteriële verspreiding op moleculair, cellulair en hele organisme te regelen.

Introduction

Shigella flexneri, een Gram-negatieve invasieve enteropathogene bacterie, kan ontsnappen uit phagosomes naar het cytosol, en polymeriseren de gastheer actinecytoskelet om cytosole immuunreacties te omzeilen en het bevorderen van intra-en intercellulaire beweging 1,2. Ondanks de kennis van actine gebaseerde motiliteit in vitro 3,4, de mechanismen beperken bacteriële verspreiding in vivo niet volledig gedefinieerd. Dit is van cruciaal belang voor een beter begrip van de aangeboren immuniteit en afweer.

Septins, een sterk geconserveerde familie van eiwitten onder metazoa, zijn guanosine trifosfaat (GTP) -bindende eiwitten die assembleren in hetero-oligomere complexen en vormen niet-polaire filamenten die associëren met cellulaire membranen en het cytoskelet 5,6. Recent werk heeft ontdekt dat geïnfecteerde gastheercellen kunnen voorkomen Shigella actine gebaseerd beweeglijkheid door compartimentering bacteriën gericht op autophagy binnen 'Septin kooien', het openbaren van de eerste cellulaire mechanisme dat actine gebaseerd beweeglijkheid 7,8 tegengaat. Een groot open veld van onderzoek ligt nu in 'Septin biologie en infectie'. Septin assemblage, veroorzaakt door een verscheidenheid aan pathogenen (bijvoorbeeld Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kan naar voren als een belangrijk punt in de afweer 5,12.

Autophagy een sterk geconserveerd intracellulair afbraakproces wordt gezien als een belangrijke component van cel-autonome immuniteit vanwege zijn vermogen om cytosolische bacteriën leveren in het lysosoom 13,14. Echter, de rol van bacteriële autofagie in vivo te beperken of te bevorderen bacteriële replicatie blijft slecht begrepen 15,16. De zebravis (Danio rerio) ontstaan ​​als een vertebraat model voor de studie van infecties omdat het optisch bereikbaarbij de larvale stadia, wanneer het aangeboren immuunsysteem is reeds functioneel 17,18. Recent werk heeft de gevoeligheid van de zebravis larven S. gekenmerkt flexneri, een paradigma voor bacteriële autofagie 15, en heeft gebruik gemaakt van de Shigella -zebrafish infectie model om de manipulatie van autofagie voor antibacteriële therapie te bestuderen in vivo 19.

Dit rapport biedt nieuwe hulpmiddelen en assays om S. studeren flexneri interacties met autofagie en het cytoskelet. In een eerste stap, protocollen monitoren autofagie cytoskelet interacties worden beschreven middels Shigella infectie van de menselijke epitheliale cellijn HeLa. Om de rol van autofagie-cytoskelet interacties op het Shigella infectieproces in vitro beoordelen methoden autofagie cytoskelet componenten (met siRNA of farmacologische reagentia) te manipuleren worden voorzien. Nieuw onderzoek heeft aangetoond dat door het gebruik van Shigella infectie of zebravis larven kunnen soortgelijke assays worden toegepast op de celbiologie van infectie in vivo te bestuderen. Protocollen voor te bereiden en te infecteren zebravis larven behandeld, en de gastheer respons op Shigella infectie in vivo te evalueren, protocollen bepalen samen overleving en bacteriële last van geïnfecteerde larven worden voorzien. Methoden om de werving van Septin en autofagie markers om Shigella controleren (met behulp van een vaste of levende zebravis larven) en methoden om de rol van deze processen te testen in vivo [behulp morfolino- oligonucleotiden (geïnjecteerd in 1-4 cel stadium embryo's) of farmacologische reagentia ( direct toegevoegd aan de zebravis badwater)] worden ook besproken. Dit programma van het werk zal naar verwachting inzicht in de voor de controle van de infectie door cytosole gastheer reacties mechanismen.

Protocol

1 Monitoring Autophagy en het cytoskelet in vitro gebruik van weefselcultuurcellen Bereid S. flexneri Plaat S. flexneri M90T (wild-type) van -80 ° C glycerol voorraad op een Congo Red tryptische soja caseïne (TCS) agarplaat. Incubeer overnacht bij 37 ° C. Dezelfde plaat kan worden gebruikt voor verschillende experimenten. Extra individuele kolonie groeien in 8 ml TCS media in een shaker nacht bij 37 ° C. OPMERKING: Congo-rode binding geeft aan dat de virulentie plasmide is behouden gebleven. Om bacteriën exponentiële groei subcultuur, enten vers TCS met de overnacht bacteriecultuur op 1/80 verdunning en groeien in een shaker bij 37 ° C tot OD600 = 0,3-0,6. Spin de bacteriële subcultuur bij 1.000 xg gedurende 5 minuten. Was de pellet met MEM en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten. Reconstrueren de pellet in MEM om OD 600 = 0.3-0.6. Bereid HeLa CeLLS voor Infectie Groeien HeLa-cellen in "compleet medium", dwz., MEM plus L-alanyl-L-glutamine, aangevuld met 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuur oplossing en 10% foetaal kalfsserum. Plate 1-1,5 x 10 5 cellen in 6-well platen 24 of 48 uur vóór de proef begint. Plaat dekglaasjes in 6-well platen voor microscopie of plaat 35 mm glazen bodem gerechten te bereiden voor levende imaging. OPMERKING: (. Bijvoorbeeld actine staarten, Septin kooien) To autofagie volgen (bijvoorbeeld ATG8 / LC3 + ve autofagosomen) cytoskelet dynamiek in real-time tijdens Shigella infectie met levende imaging, kan weefselkweek cellen tijdelijk worden getransfecteerd met GFP, RFP- of GVB-gemerkte constructen (zie Discussie). Infectie Infect cellen met 100: 1 multipliciteit van infectie (MOI) van Shigella (OD 600 = 0,3-0,6) verdund in MEM; direct In HeLa-cellen uitgeplaat in 6-well platen 24 – 48 uur voorafgaand aan de infectie (zoals beschreven in paragraaf 1.2) in 2 ml MEM (serum uitgehongerd). Om bacteriële hechting maximaliseren cellen centrifuge bacteriën en gastheercellen bij 700 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur geroerd. Na centrifugeren gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2 en laat infectie gaan. Was geïnfecteerde cellen tweemaal met vers MEM en geïncubeerd met compleet medium bevattende gentamicine (50 ug / ml, extracellulaire bacteriën onschadelijk) voor 1-4 uur afhankelijk van het experiment. Vaststelling en etikettering geïnfecteerd HeLa cellen voor Microscopie Was geïnfecteerde cellen tweemaal met 1x PBS en vast 15 min in 4% paraformaldehyde in 1x PBS bij kamertemperatuur. Om paraformaldehyde verwijderen, wassen cellen 2x met 1x PBS. Incubeer gefixeerde cellen in 50 mM ammonium chloride voor 10 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was eenmaal met 1x PBS en doorlaatbaar cellen gedurende 4 min met 0,1% octylfenol ethyleenoxide condensaat bij kamertemperatuur temperature. OPMERKING: Alternatieven voor ethyleenoxide condensaat octylfenol voor permeabilisatie, zoals saponine of methanol, kan worden toegepast voor verschillende behoud van cellulaire structuren 20. Was de cellen in 1x PBS en incubeer in natte kamer met primaire antilichamen tegen autofagie kritische componenten (bijvoorbeeld P62 / SQSTM1) of de Septin cytoskelet (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9 en sept11 worden uitgedrukt in HeLa-cellen) gedurende 30 minuten (bij kamertemperatuur) tot 's nachts (4 ° C). Was de cellen tweemaal met 1x PBS en incubeer bij natte kamer met secundaire antilichamen, en label filamenteus actine (F-actine) met falloïdine, gedurende 30 minuten (bij kamertemperatuur) gedurende een nacht (bij 4 ° C). Voor kleuring gastheercel kernen commentaar 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Was de cellen in 1x PBS en monteer de dekglaasjes op dia's met behulp montage medium. Microscopische Beeldvorming van Infected HeLa cellen Om het beeld van de infecteerd cellen gebruiken een epifluorescentie of confocale microscoop en een 63X of 100X doelstelling DAPI-gelabelde Shigella identificeren. OPMERKING: Zoals in de figuren 1A – 1C, kan Septin kooien worden gevisualiseerd als ring achtige structuren, ~ 0,6 micrometer in doorsnede, omliggende cytosole bacteriën polymeriseren actine en het werven van autofagie markers (bijvoorbeeld P62 en LC3) 7,8. Daarentegen zullen bacteriën polymeriseren actine staarten niet worden gecompartimenteerd door Septin kooien en zal niet worden gericht op autofagie 7,8. Met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop en een 63X of 100X doelstelling te kwantificeren van het aantal intracellulaire bacteriën per microscopisch veld. Ook kwantificeren van het aantal bacteriën ingesloten in Septin kooien en gericht op autofagie, of polymeriseren actine staarten en ontsnappen autofagie. Om het percentage bacteriën ingesloten in Septin kooien of polymeriseren actine staarten te bepalen, neem een ​​afbeelding Z-stack reeks Infected cellen, het proces van de beelden en tel minstens 500-1000 bacteriën per experiment uit tenminste 3 onafhankelijke experimenten. 2 Functionele Analyse van autofagie en het cytoskelet In Vitro OPMERKING: Zowel genetische als farmacologische benaderingen mogelijk om autofagie verstoren in geïnfecteerde weefselkweek cellen en het effect van deze behandelingen op het verloop van de infectie kan worden gecontroleerd. siRNA zwijgen Plaat 0,8 x 10 5 HeLa cellen op dekglaasjes in platen met 6 putjes in compleet medium. Transfecteren de volgende dag met een lipide-gebaseerde transfectie reagens met siRNA tegen autofagie en / of cytoskelet markers. Na de gewenste periode van incubatie, besmetten de cellen met Shigella zoals beschreven in paragraaf 1.3. Fix en het etiket van de cellen zoals beschreven in paragraaf 1.4. Farmacologische manipulatie <br /> LET OP: Het cytoskelet kan farmacologisch worden gemanipuleerd, bijvoorbeeld om depolymeriseren het actine cytoskelet gebruik cytochalasine D of latrunculin B, te depolymeriseren microtubuli gebruiken nocodazole, om actomyosine activiteit gebruik blebbistatin blokkeren, of om Septin montage gebruik forchlorfeneuron verstoren. Autophagy kan worden gestimuleerd door rapamycine of geblokkeerd door bafilomycine. Om het cytoskelet tijdens Shigella infectie te manipuleren, eerst besmetten de cellen met Shigella, zoals beschreven in paragraaf 1.3 en laat voldoende tijd voor bacteriën om cellen binnen te dringen en te ontsnappen aan de phagosome naar het cytosol (bijv.,> 1,5 uur na infectie). Verdun de geneesmiddelen uit de voorraadoplossing [voorraadoplossing gesuspendeerd in dimethylsulfoxide (DMSO)] in MEM tot een eindconcentratie van 5 M (cytochalasine D, latrunculin B, nocodazole), 20 M (forchlorfeneuron) of 50 M (blebbistatin) en behandelen cellen 30 min bij 37 ° C. De totale hoeveelheid van het geneesmiddel (het volume van de DMSO / drug mengsel) toegevoegd per plaat / flacon cellen 1-5 pl (afhankelijk voorraadoplossing) per 2 ml medium. Behandel de cellen met een vergelijkbare dosis DMSO verdund in MEM als een negatieve controle. Fix en het etiket van de cellen zoals beschreven in paragraaf 1.4. OPMERKING: manipulatie van autofagocytische flux (in geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen) uitstrekken medicatie met rapamycine (20 nM) of bafilomycine (160 nM) van 4 tot 12 uur. Western Blot OPMERKING: autophagic activiteit kan worden gekwantificeerd door het meten van het eiwitgehalte van autofagie markers zoals p62 en LC3. Na de gewenste incubatietijd verzamelen en lyseren van de cellen voor immunoblotting. Run eiwitextracten op 8, 10, of 14% acrylamide gels. Autophagic flux, dwz. de snelheid van autofagie, kunnen worden geanalyseerd zoals beschreven in 21,22. Microscopische Beeldvorming en kwantificering Met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop en een 63X en 100X objective, het effect van siRNA of behandeling met geneesmiddelen op Shigella infectie kan worden geëvalueerd door kwantitatieve microscopie (dat wil zeggen, het tellen van autofagosomen, Septin kooien en actine staarten), zoals beschreven in paragraaf 1.5 en weergegeven in de figuren 2A en 2B. 3 In vivo beeldvorming van S. flexneri Interacties met autofagie en het cytoskelet OPMERKING: De zebravis model van Shigella infectie kan worden gebruikt om Septin kooien en autofagie in vivo 19 onderzoeken. Bereid S. flexneri Cultuur S. flexneri zoals beschreven in paragraaf 1.1. Bij OD600 = 0,3-0,6, rotatie 8 ml bacteriële subcultuur bij 1000 xg gedurende 10 minuten. Was de pellet met 1x PBS en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in 80 gl 0,1% fenolrood 1x PBS ~ 2000 bacteriën / nl verkrijgen. Houd de bacterial voorbereiding op het ijs te vertragen groei. OPMERKING: Het toevoegen van fenol rood zal helpen om de entstof te visualiseren bij het injecteren in de larven. Bereid zebravis Larven voor Injectie OPMERKING: zebravis worden gelegd als eieren en worden geïdentificeerd als embryo's tot 72 uur na de bevruchting, als ze larven worden genoemd. Ras volwassen zebravissen zoals beschreven in Westerfield 23 door het plaatsen 4 mannen en 8 vrouwen (gewoonlijk een verhouding 2: 1) een afzonderlijke vis tank met de bodem bedekt met knikkers (die voorkomt volwassenen uit eten van de eieren voortgebracht). Als alternatief plaatst ei collectie manden in de kweekbakken de avond tevoren. OPMERKING: De eieren worden bevrucht ~ 30 minuten na de lichten gaan aan in het zebravis-faciliteit 23, en moeten zo snel mogelijk worden verzameld om schimmelgroei te voorkomen. Eierverzameling manden dienen om de eieren te verzamelen, zodat ze gemakkelijk kunnen worden geoogst en ook de bescherming van de eieren van volwassenen. Het verzamelen van de embryos en ze schoon door wassen in embryo medium (E2) met 0,003% bleekmiddel voor 10 minuten. Verwijder E2 met bleekmiddel wassen embryo 5x in E2 medium en groeien de embryo 10 cm Petrischaal (100 embryo / 50 ml E2 medium) bij 28 ° C. Wanneer embryo's of larven zullen worden gebruikt voor microscopie studies bij 24 uur na bevruchting commentaar 0.003% N-fenylthioureum het E2 medium melanisatie voorkomen. Houd de embryo's bij 28 ° C voor een normale ontwikkeling. OPMERKING: zebravis larven zijn klaar voor infectie op 72 uur na de bevruchting. Voor infectie en microscopie procedures, verdoven zebravis larven in 200 g / ml tricaïne in E2. Voorbereiding van de zebravis Larven voor intraveneuze en lokale infectie OPMERKING: Om de zebravis overleving te bepalen tijdens Shigella infectie, voeren caudale intraveneuze injecties. De aanwerving van Septin en autofagie markers om Shigella visualiseren, presteren infectie op gelokaliseerde sites, zoals de staart spier. Voor een caudale intraveneuze injectie, de positie van de narcose larven lateraal met de dorsale zijde van de naald. Zoals getoond in figuur 3A, plaatst de naald afsluiten (posterior) de urogenitale opening, streven naar de staartader en doorboren de huid en leveren de gewenste bacteriële dosis (injectievolume 1-5 nl). OPMERKING: Intraveneuze infectie is uitdagend om uit te voeren en zal enkele weken van de opleiding nemen om comfortabel met deze procedure krijgen. Injecteren van fenol rood (zonder bacteriën) voor de training zal helpen om de injectieplaats goed te kunnen beoordelen. OPMERKING: Bij Shigella, hebben dosisafhankelijke experimenten aangetoond dat een lage dosis infectie (<1000 CFU) wordt binnen 48 uur verwijderd, en een hoge dosis infectie (> 4000 CFU) leidt tot sterfte systeem binnen 48 uur 19. Voor een staart spier infectie, de positie van de verdoofde larven zoals beschreven in paragraaf 3.3.1. Zoals getoond in figuur 3A, plaatst de naald voorzichtigy dan spier somieten (dwz, segmenten van de skeletspieren) en spuit een klein volume (dwz., 1 nl) van bacteriële voorbereiding. Intraveneuze injectie van bacteriën in Larven Trek borosilicaatglas microcapillairen zoals beschreven in 24. Sluit de naald aan de houder van het driedimensionale grof handleiding manipulator en breekt de naald met een fijne pincet. Om de naald te laden, plaats een druppel bacteriecultuur op een dekglaasje. Schakel de microinjector en gascilinder, enigszins onderdompelen naald in de onderstaande, en vullen de naald met de gewenste hoeveelheid bacterieel preparaat. Om de injectie volume te kalibreren, plaats een druppel minerale olie op een dekglas en injecteer de bacteriële voorbereiding. Meet de diameter van de druppel met een micrometer en bereken het geïnjecteerde volume [V = (4/3) πr 3]. LET OP: Het gebruik van injectie instellingen van 40 psi en 50 msec met een bacterial preparaat zoals beschreven in paragraaf 3.1 zal ~ 2000 CFU / nl geven. Bereid de injectie plaat met behulp van een plastic mal, zoals beschreven in Westerfield 23. Breng de larven op de injectie plaat en lijn ze up met een fijn penseel. Orient en injecteer de larven zoals beschreven in paragraaf 3.3.1. Voor beoordeling van zebravis overleving, overdracht geïnfecteerde larven individueel in 24-well platen in 1 ml E2 / putje en incubeer bij 28 ° C. Bewaken van de besmette larven per dag gedurende de komende 2-5 dagen en plot voortbestaan ​​in de tijd (Figuur 3B). Plating zebravis Larven voor Bacteriële kwantificering LET OP: Brei onder een steriele kap om besmetting te voorkomen. Om het aantal bacteriën geïnjecteerd in de vis (op tijdstip 0 uur na infectie) en voor bacteriële kwantificatie op gewenste tijdstippen evalueren offeren zebravis larven met een overdosis tricaïne (200-500 mg / L). Plaats individuele larven in 1,5 ml polypropylene microcentrifugebuis met 200 ul 0,1% octylfenol ethyleenoxide condensaat 1x PBS en mechanisch homogeniseren met stamper. OPMERKING: Om de bacteriële verontreiniging in het injectie-volume te bevestigen, pomp een gelijke dosis in een steriele 1x PBS druppel en plaat het uit. Voeg een seriële verdunning van de zebravis larven homogenaten in steriel water en plaat op lysogenie bouillon (LB) agarplaten. Larven kunnen ook worden verzilverd op Congo Red TCS platen te maken tussen Shigella de virulente plasmide hebben behouden of niet. OPMERKING: Plaat 3 of meer geïnfecteerde vis als controle om de status van de zebravis larven gebruikt voor de infectie controleren. Na overnacht incubatie van de platen bij 37 ° C, tellen bacteriële kolonies. Zoals getoond in figuur 3C, vormen met een logaritmische schaal. OPMERKING: Bacteriële belasting tijdens infectie van de zebravis larven kunnen ook worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde Shigella en microscopische imaging zoals beschreven in paragraaf 3.7 of 3.8 (Figuur 3D). Zebravis Larven Immunokleuring Op gewenste tijdstippen, offeren de larven met een overdosis tricaïne. Verzamel de vis in 1,5 ml microcentrifuge buizen van polypropyleen (10 tot 20 larven / buis). Bevestig de larven met 4% paraformaldehyde 0,4% octylfenol ethyleenoxide condensaat in 1x PBS en geïncubeerd in een orbitale roerder 2 uur (bij kamertemperatuur) of overnacht (larvale clustering te voorkomen) (bij 4 ° C). OPMERKING: Elektronenmicroscopie kan voor ultrastructurele analyse van geïnfecteerde zebravis larven. In dit geval moet geanesthetiseerd embryo's worden gefixeerd en verwerkt volgens Mostowy c.s. 19. Was 3x in 1x PBS 0,4% octylfenol ethyleenoxide condensaat in 5 min, blokkeert vervolgens in blokkeeroplossing (10% foetaal kalfserum, 1% DMSO, 0,1% polyoxyethyleensorbitanmonolauraat in 1x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Diluit het primaire antilichaam in blokkerende oplossing. Larven In verdunde primaire antilichaam en incubeer overnacht bij 4 ° C in een orbitale agitator. Gebruik primaire antilichamen zoals hierboven beschreven in paragraaf 1.4.3. Was de larven 4x gedurende 15 min in 0,1% polyoxyethyleensorbitanmonolauraat 1x PBS bij kamertemperatuur. Verdun het secundaire antilichaam in blokkerende oplossing. Larven In verdunde secundair antilichaam en incubeer overnacht bij 4 ° C in een orbitale agitator. Gebruik dezelfde secundaire antilichamen en phalloidin zoals beschreven in paragraaf 1.4.4. Was 4x gedurende 15 min in 0,1% polyoxyethyleensorbitanmonolauraat 1x PBS bij kamertemperatuur. Voor kleuring gastheercel kernen commentaar DAPI (150 nM eindconcentratie) gedurende het eerste van deze 15 min wassingen. Voor handhaving van een fluorescent gelabelde larven, incubeer ze geleidelijk in een glycerol gradiënt van 15, 30, 60 en 80% verdund in 1x PBS en 0,1% polyoxyethyleensorbitanmonolauraat 2 uur (at room temperAard) overnacht (bij 4 ° C). OPMERKING: Stained larven kunnen worden opgeslagen voor langere tijd in 80% glycerol bij 4 ° C (bijvoorbeeld 4 maanden.). Microscopische Beeldvorming van Vaste zebravis Larven Transfer vaste glycerol ingebed larven tot een kleine daling van 80% glycerol in een 35 mm petrischaal (voor stereomicroscopie) of vol glas onderste schaal (voor confocale miscopy). Neem Z-stack image serie van besmette larven en verwerken van de afbeeldingen. Gebruik een epifluorescentie of confocale microscoop en een 10X of 20X objectief voor hele organisme beeldvorming. Maak dan gebruik van een confocale microscoop en een 40X, 63X of 100X doel om individuele cellen te visualiseren en de werving van autofagie en cytoskelet markers om individuele bacteriën in vivo 19 (figuren 4A en 4B). OPMERKING: Infect vissen in de staart spier en houder van glycerol vlak langs de bodem van de glazen bodem gerecht ea inschakelensy focus. Leef Microscopische Beeldvorming van Infected zebravis Larven OPMERKING: Larven zijn optisch toegankelijk, dus in vivo autofagosomen kan worden gevisualiseerd met behulp van de GFP-Lc3 zebravis transgene lijn 25. Infecteren zebravis larven, zoals beschreven in paragraaf 3.3 en mount, zoals beschreven in deze sectie. Bereid laagsmeltende 1% agarose (LMA) in E2 en laat afkoelen tot 35-37 ° C larven schade / doden voorkomen. Verdeel druppels LMA in een 35 mm petrischaal (voor stereomicroscopie) of vol glas onderste schaal (voor confocale microscopie). Transfer verdoofd zebravis larven individueel (met zo weinig mogelijk water) aan de LMA daalt. Orient larven naar de gewenste positie met een penseel en wacht op de agarose te stollen. Bedek het hele gerecht oppervlak met LMA en overlay met E2 dat 200 ug / ml tricaïne de bereiding uitdroging wordt vermeden en dat vis zuurstof wisselen van het water. Gebruik een epifluorescentie of confocale microscoop en een 10X of 20X objectief voor de beeldvorming van de gehele zebravis larven. Gebruik een confocale microscoop en een 40X, 63X, 100X of objectieve bacteriële authopagosomes visualiseren (dwz GFP-Lc3 + ve vacuolen rond Shigella) in vivo. Neem een Z-stapel geïnfecteerde larven tijd (bijv. Elke 2 minuten over meerdere h) teneinde autofagosomen visualiseren en hun dynamiek, in real time. 4 Functionele Analyse van autofagie en het cytoskelet in vivo OPMERKING: De invloed van farmacologische en genetische verstoringen van autofagie op het verloop van de infectie kan worden gecontroleerd op het hele dier-niveau en op het niveau van de enkele cel. Autofagie Manipulatie door Morfolino Injection Reconstitueren morfolino oligonucleotiden in steriel water om een ​​voorraadoplossing van 1 mM door verwarming bij 65 ° C gedurende 10 minuten. Bewarenbij kamertemperatuur. OPMERKING: morfolino oligonucleotide injecties moeten 1-4 cel embryo's worden uitgevoerd. Bereid morfolino oligonucleotide werkoplossing met steriele 0,1% fenol rood in Dulbecco's met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Laad de naald, zoals beschreven in paragraaf 3.4.2., Kan morfolino- oligonucleotide injectie volume gekalibreerd worden zoals beschreven in paragraaf 3.4.3. OPMERKING: Phenol red helpt de geïnjecteerde volume visualiseren. Bereid een embryo-positionering kamer (dwz., Een microscoop dia gelijmd met cyanoacrylaat op een 10 cm petrischaal deksel met randen met uitzicht op de naald gedeeltelijk verwijderd). Transfer 1-4 cellig stadium embryo's naar de kamer met een kleine hoeveelheid water en breng deze met een fijn penseel. Doordringen in het chorion en de dooier soepel. Eenmaal binnen, druk op het pedaal om het gewenste volume van morpholino oligonucleotide oplossing te injecteren. OPMERKING: Minimaliseer het volume van de injectie om 0,5-2 nl; volumes hoger than 5 nl kan ontwikkelingsstoornissen afwijkingen veroorzaken en ei sterfte verhogen. Na micro-injectie, schone embryo's (door bleken, zoals beschreven in paragraaf 3.2) en incubeer ze in een petrischaal met E2 bij 28 ° C. Infecteren 72 uur na de bevruchting controle (dwz, zebravis larven geïnjecteerd met controle morfolino oligonucleotide) of p62 morphants (dwz., Zebravis larven geïnjecteerd met p62 morpholino oligonucleotide) met Shigella, zoals beschreven in paragraaf 3.4. Beoordelen van de overleving en bacteriële last voor de komende 2-5 dagen zoals beschreven in paragraaf 3.5. Afbeelding vaste zebravis larven zoals beschreven in paragraaf 3.7 en gemarkeerd in figuur 4C, of afbeelding levende zebravis larven zoals beschreven in paragraaf 3.8. OPMERKING: Het effectieve morfolinogroep oligonucleotide dosis kan worden beoordeeld op basis van de efficiëntie te transcript splicing of eiwit vertaling (zie Discussie) remmen.

Representative Results

Na infectie van weefselkweekcellen in vitro, S. flexneri kan ontsnappen uit de phagosome en binnen te vallen het cytosol. In het cytosol, kunnen gastheercellen de actine gebaseerde beweeglijkheid van Shigella te voorkomen door compartimentering van bacteriën in Septin kooien (figuur 1A). Bacteriën ingesloten door Septin kooien kan ook worden gelabeld door autofagie markers p62 (Figuur 1B) en LC3 (figuur 1C). Deze waarnemingen markeert een nieuw mechanisme van afweer die verspreiding van invasieve pathogenen beperkt, en ook onthullen nieuwe verbindingen tussen autofagie en het cytoskelet. Opvallend is dat de uitputting van autofagie markers aanzienlijk vermindert Septin kooien van bacteriën (Figuur 2A), en het werk heeft ook aangetoond dat de uitputting van Septin kooien vermindert werving van autofagie 8 markers. Aldus, althans bij Shigella, Septin kooiconstructie en autophagosome vormingenn kunnen worden gezien als onderling afhankelijke processen. Andere cellulaire eisen voor compartimentering van Shigella door Septin kooien bevatten actine polymerisatie en actomyosine activiteit (figuur 2B). Er is geen natuurlijke muismodel van shigellose, en het onderzoek van Shigella pathogenese, Septin biologie en bacteriële autofagie in vivo kunnen profiteren van een nieuw diermodel van infectie, de zebravis larven 19. Het is mogelijk zebravis larven besmetten injecteren bacteriën in verschillende anatomische plaatsen zoals caudale intraveneuze injecties overlevingsexperimenten en staart spier injecties in vivo microscopie (figuur 3A). Afhankelijk van de dosis, S. flexneri geïnjecteerd in de zebravis larven kan ofwel binnen de 48 uur na de infectie worden gewist, of kan leiden tot een progressieve en uiteindelijk fatale infecties (Figuren 3B – 3D). Shigella virulentie factors expressie bij 28 ° C, de optimale groeitemperatuur van zebravis en zebravis infectie door Shigella strikt afhankelijk van het type III secretiesysteem (T3SS) 19, in menselijke ziekte een belangrijke determinant voor virulentie. Genomen samen, deze waarnemingen wijzen erop dat de zebravis larven een waardevolle nieuwe host voor in vivo analyse van Shigella infectie. De optische toegankelijkheid van de zebravis larven maakt visualisatie van Septin kooien in vivo (figuur 4A), een prestatie die nog nooit eerder is uitgevoerd met behulp van zoogdiergastheer- modellen. Om bewijs te vullen dat Septin kooien vangen bacteriën gericht op autofagie in vivo, kan men transgene zebravis larven te infecteren die GFP-Lc3 en observeren autofagie marker rekrutering van Shigella (Figuur 4B). Voor ultrastrucutral analyse van Shigella autofagosomen in vivo, elEctron microscopie kan worden gebruikt om duidelijk de cytosolische vastlegging bacteriën door dubbel membraan vacuolen 19. Autofagie wordt gezien als een belangrijke component van cel-autonome immuniteit en een cruciale afweermechanisme tegen intracytosolic bacteriën 14-16. Om autofagie functie karakteriseren in vivo, kan p62-morpholino behandeld zebravis larven worden gebruikt. In tegenstelling tot de kern autophagy machines [bv. De 36 autophagy verwante eiwitten (ATG) 26], p62 is niet essentieel voor de ontwikkeling van vertebraten 27 en dus zebravis larven gewoonlijk vóór infectie. Opvallend-p62 uitgeput larven geënt met S. flexneri resulteren in significant verhoogde mortaliteit en een verhoogde bacteriële last 19. In overleg met de in vitro werk waaruit blijkt dat Septin kooiassemblage is onderling afhankelijk met autophagosome formatie 7,8, wordt Septin rekrutering voor Shigella duidelijk in-p62 uitgeputte larven verminderd ( <strong> Figuur 4C). Deze gegevens tonen aan dat zebravis overleving afhankelijk-p62 gemedieerde autofagie intracellulaire bacteriële besmetting te bestrijden. Figuur 1 De Septin kooi in vitro. (A) HeLa-cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT9 en falloïdine en afgebeeld door confocale microkopie. Schalingsbalk werden 1 urn. (B) HeLa-cellen geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen p62 en SEPT2 en afgebeeld door fluorescerend licht microscopie. Schalingsbalk werden 1 urn. (C) HeLa-cellen getransfecteerd met GFP-ATG8 / LC3, geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT2 en afgebeeld door fluorescerende microscopy. Schaal bar, 1 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd vanaf Mostowy et al 7. Figuur 2 Cellular eisen Shigella -septin kooi formatie. (A) HeLa-cellen werden behandeld met controle (CTRL), p62, ATG5, ATG6 of ATG7 siRNA. Hele cellysaten van siRNA behandelde cellen werden immunoblotting voor GAPDH, p62, ATG5, ATG6 of ATG7 de doeltreffendheid van siRNA depletie (boven) vertonen. -siRNA behandelde cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri gedurende 4 uur 40 min, vast, en gelabeld voor kwantitatieve microscopie. Grafieken (onderaan) stellen het gemiddelde ± SEM% van Shigella binnen SEPT2 kooien van n ≥3 experimenten per behandeling. (B) HeLa-cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri, behandeld met DMSO, cytochalasine D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazole (Noco), of blebbistatin (Bleb) en na 4 uur 40 min werden vastgesteld en gelabeld voor kwantitatieve microscopie. Grafieken geven het gemiddelde% ± SEM van Shigella binnenkant SEPT2 kooien van twee onafhankelijke experimenten per behandeling. Deze cijfers zijn gewijzigd ten opzichte van Mostowy et al 7. Figuur 3 De zebravis model van Shigella infectie. (A) De beelden illustreren oriëntatie van de zebravis larven onder de stereomicroscoop. (Linker paneel) zebravis larven 72 uur na de bevruchting werden lateraal gepositioneerd in de injectie plaat met hun dorsale zijde naar de injectienaald. (Midden-panel) bloedbaan infectie werd uitgevoerd door injecterende de bacteriën (rode oplossing) in de staartader, posterieur van de urogenitale opening. (Rechter paneel) Infectie in de staart spier werd uitgevoerd door injectie van bacteriën (rode oplossing) over een somite. (B) overlevingscurven van 72 uur na de bevruchting larven geïnjecteerd met verscheidene doses S. flexneri en geïncubeerd bij 28 ° C gedurende 48 uur na infectie. De effectieve entstof werd geclassificeerd als laag (<10 3 CFU, open cirkels), medium (~ 4 x 10 3 CFU, open driehoeken) of hoog (~ 10 4 CFU, open vierkantjes). Bedoel% ± SEM (horizontale balken) uit n ≥3 experimenten per inoculum klasse. (C) Bepaling van het aantal levende bacteriën in homogenaten van individuele larven op verschillende tijdstippen na infectie gemeten door platen op LB Let op, alleen larven na de infectie worden opgenomen in opsomming analyse overleefd. Gemiddelde ± SEM (horizontale balken) ook weergegeven. (D) Verdeling van GFP Shigella bepaald doorlive-beeldvorming met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop op verschillende tijdstippen na infectie met een lage, gemiddelde of hoge dosis entstof (caudale intraveneuze injecties). Overlay beeldoverdracht (grijs) en GFP-fluorescentie (groen) (B), van -. (D) hebben deze cijfers aangepast is Mostowy et al 19. Figuur 4 De celbiologie van Shigella infectie in vivo. (A) zebravis larven werden geïnfecteerd in de staart spier GFP Shigella (lage dosis) gedurende 24 uur, vastgesteld gelabeld met antilichamen tegen SEPT7 (rood) en GFP (green ) en afgebeeld door confocale microscopie. Schaal bar, 5 micrometer. (B) GFP-Lc3 zebravis larven besmet waren met mCherry- Shigella (medium dosis) voor4 uur, vastgesteld gelabeld met antilichamen tegen mCherry (rood) en GFP (groen) en afgebeeld door confocale microscopie. . Schaal bar, 1,5 micrometer (C) zebravis larven behandeld met ofwel controle (CTRL; linker afbeelding) of P62 (rechter afbeelding) morpholinos waren geïnfecteerd met GFP Shigella gedurende 4 uur (medium dosis), vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT7 ( rood) en GFP (groen) en afgebeeld door confocale microscopie. Pijlen markeren enkele voorbeelden van Shigella ingesloten in Septin kooien (CTRL) of niet (p62 verarmd) een 4 uur na infectie. Schaal bar, 5 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd vanaf Mostowy et al 19.

Discussion

Bij het ​​bewaken van autofagie en het cytoskelet in vitro met behulp van weefselkweek cellen, kunnen de in de punten 1 en 2 beschreven protocollen worden toegepast op een breed scala van weefselkweek celtypes. Bovendien zou autofagie volgen (bijvoorbeeld ATG8 / LC3 + ve autofagosomen) en cytoskelet (bv. Actine staarten, Septin kooien) dynamica in real-time tijdens Shigella infectie met levende imaging, kan weefselkweek cellen tijdelijk worden getransfecteerd met GFP, RFP- of GVB-gemerkte constructen zoals eerder beschreven 7,8. (. Dwz algemeen wenselijk voor real-time analyse aangezien Shigella kan binnendringen 5-30% van HeLa-cellen bij 100 1 MOI) Om het percentage cellen geïnfecteerd door Shigella verhogen, direct voeg 400 ul van Shigella (OD 600 = 0,3 -0.6) om cellen in 2 ml MEM (serum uitgehongerd) en wacht ten minste 1,5 uur na infectie voldoende bacteriële binnenkomst, ontsnappen aan de phagosome, replicatie, autophagy erkenning en Septin kooien. Als alternatief kan men de Shigella M90T Afai stam die drukt de adhesine AfaE en hebben veel hogere invasie vaardigheden in epitheliale cellen in vergelijking met de M90T stam 28 gebruiken. Van de nota, de M90T Afai stam is nog niet in vivo getest met behulp van de zebravis. Platen van Shigella kolonies bij 4 ° C bewaard gedurende 2-3 dagen en voor verschillende experimenten. Na verloop van tijd, kolonies van Shigella dat de virulentie plasmide kan absorberen Congo Red en lijken hebben verloren hun virulentie plasmide behouden. Om deze reden adviseren wij om verse bacteriële voorraden te gebruiken als dat mogelijk is.

Bij het ​​bewaken van de celbiologie van de infectie in vivo, protocollen beschreven in de hoofdstukken 3 en 4 maken gebruik van wildtype AB lijn zebravis. Om Shigella -leukocyte interacties monitoren, kunnen transgene zebravis lijnen worden gebruikt, bijvoorbeeld, MPX: GFP of Lyz: DsRed om visueleize neutrofielen 19,29,30 of mpeg1: mCherry om macrofagen 19,31 visualiseren. Om autofagie te visualiseren in vivo, kan het GFP-Lc3 zebravis transgene lijn 19,24 worden gebruikt zoals beschreven in paragraaf 3.8.

Om autofagie verstoren in vivo, de effectieve morfolino oligonucleotide dosis moet proefondervindelijk worden bepaald op basis van de efficiëntie transcript splicing of eiwittranslatie remmen. Het is raadzaam om een titratie experiment uitgevoerd en de uitputting van RT-PCR (voor splice morfolino oligonucleotide) bevestigen of door SDS-PAGE (voor translationeel morfolino oligonucleotide) 32. RNA isolatie van zebravis embryo's en larven kan worden uitgevoerd met guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Om eiwitten extraheren uit zebravis larven (8 tot 15 larven / buis), mechanisch homogeniseren met stamper in 200 ul lysis buffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% octylfenol ethyleenoxide condensate en protease inhibitor). Centrifugeer buizen bij 19.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min en breng het supernatant naar een nieuwe buis. Voeg Laemmli buffer en verwarm het monster bij 95 ° C gedurende 15 minuten. Lysaten kunnen bij -80 ° C bewaard totdat het nodig is, en kan worden geëvalueerd door Western blotting zoals beschreven in paragraaf 2.3.

De zebravis is een uitstekend model voor in vivo drug toepassing. Analyse middels morfolino oligonucleotiden kunnen worden aangevuld met gevestigde drugs autofagie (bijvoorbeeld rapamycine en bafilomycine) manipuleren. Uninfected en / of geïnfecteerde larven worden behandeld met rapamycine (1,5 uM) of bafilomycine (80 nM) verdund in E2 en autofagocytische flux kan worden geëvalueerd door Western blotting zoals beschreven in 25,33. Het gevolg van autofagie manipulatie van de uitkomst van de infectie en de overleving van de larven besmet kunnen worden geëvalueerd zoals beschreven in paragraaf 3.5.

Naast het bestuderen gastheerceldeterminanten, in vitro en in vivo protocollen kunnen worden toegepast om bacteriële determinanten vereist autofagie herkenning te bepalen, waarbij bacteriële mutante stammen die differentieel worden herkend door autofagie, bijvoorbeeld., Shigella ΔicsA (de Shigella eiwitten ICSA rekruteert N-WASP en vervolgens Arp2 / 3 voor actine staart en Septin kooi vorming, in de afwezigheid ervan kan er geen actine staarten, geen Septin kooien) en ShigellaΔicsB (Shigella vermijdt de autophagic reactie via de bacteriële effector eiwit ICSB, die de werving van autofagie machines ICSA voorkomt, in zijn afwezigheid er kunnen meer Septin kooien, meer autofagie) 7,8.

Shigella is geen natuurlijk pathogeen van de zebravis en groeit optimaal bij 37 ° C. Echter, heeft het werk aangetoond dat virulentie factoren die nodig zijn voor Shigella invasie, ontsnappen aan de fagocytaire vacuole en replicatie in de cytosol kan worden uitgedrukt en zijn functioneel in zebravis larven bij 28 ° C 19. 28 ° C is het meest gebruikte temperatuur zebravis toegepast en standaardtemperatuur normale zebravis ontwikkeling 23 waarborgen. Opvallend zijn de belangrijkste pathogene gebeurtenissen die tot shigellosis mens (dwz macrofaag celdood, invasie en vermenigvuldiging in epitheelcellen, cel-cel verspreiding, inflammatoire destructie van de ontvangende epitheel) getrouw weergegeven in de zebravis model van Shigella infectie 19.

Autofagie en cytoskelet genen zijn alomtegenwoordig uitgedrukt en hebben een breed scala van biologische functies. Mouse studies hebben aangetoond dat knockout essentiële autofagie 26 of Septin genen 5 zijn embryonaal lethaal, en het is waarschijnlijk dat sommige van deze genen essentieel voor de ontwikkeling van de zebravis (wordt hoewel dit probleem kan worden verminderd door het feit dat meerdere zebravisparaloge genen 33). Dan zijn er verschillende alternatieven voor dit probleem, bevattende (i) het gebruik van farmacologische reagentia autofagie en het cytoskelet reguleren, (ii) morfolino kan worden getitreerd beneden verholpen, (iii) knockout van genen worden ontworpen voor specifieke cel types, en / of (iv) genen betrokken bij autofagocytische inzicht dat niet essentieel voor de ontwikkeling dier (bv., P62) worden gericht.

Terwijl de zebravis is een ideaal modelsysteem om autofagie en het cytoskelet tijdens Shigella infectie te onderzoeken, zijn moleculaire technieken momenteel ontbreekt. Het veld moet om nieuwe instrumenten en rijden cel specifieke expressie van de eiwitten van belang te genereren. Neerhalen uitdrukking van autofagie / cytoskelet genen, zijn nieuwe morpholino sequenties nodig, en nieuwe methoden voor het genoom techniek (bijvoorbeeld, TALEN, CRISPR / Cas9) kan ook worden gebruikt. In de tussentijd verschillende tools die eerder gegenereerd voor mens of muis studieskan eveneens werken voor de zebravis.

De intracellulaire bacteriën S. flexneri heeft ontpopt als een uitzonderlijke modelorganisme om belangrijke kwesties in de biologie, waaronder het vermogen van bacteriën om erkend te worden door het immuunsysteem 1,2 pakken. De gastheercel maakt gebruik septins om de beweeglijkheid van S. beperken flexneri en richten ze naar autofagie, een essentieel onderdeel van een cel autonoom immuniteit 7,8. Deze waarnemingen suggereren een nieuwe moleculaire kader om autofagie en zijn vermogen om cytosole bacteriën afgebroken studie. Een belangrijke kwestie is nu volledig ontcijferen van de onderliggende moleculaire en cellulaire gebeurtenissen, en deze gebeurtenissen in vitro tijdens bacteriële infectie in vivo geanalyseerd met behulp van relevante diermodellen valideren. Daartoe is de zebravis vastgesteld als een waardevolle nieuwe gastheer voor de analyse van S. flexneri infectie 19. Interacties tussen bacteriën en gastheercellen kan worden afgebeeld op hoge resolutie, ende zebravismodel moet nuttig zijn voor het begrijpen van de celbiologie van Shigella infectie in vivo aantonen. Zebravis larven kan worden gebruikt om de rol van bacteriële autofagie afweer onderzoeken en werk heeft aangetoond dat de verstoring van autofagie nadelig kunnen beïnvloeden mogelijk overleving in respons op Shigella infectie 19.

De opmerkingen gegenereerd uit onderzoek van Shigella, Septin kooien en autofagie in vitro middels weefselkweek cellen en in vivo in zebravis larven kunnen fundamentele vorderingen in het begrijpen afweer verschaffen. Ze konden ook voorstellen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën ter bestrijding van infectieziekten.

Een kritische doel van dit rapport is het gevoel van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen in vitro geanalyseerd te maken (dat wil zeggen, autofagie, actine staarten, Septin kooien) tijdens bacteriële infectie in vivo in het kader van een entire organisme, met behulp van de zebravis larven. Als niet bekend is met de zebravis biologie en behandeling, kan men verwijzen naar in de diepte protocollen voor een goede zebravis veeteelt 23 en in vivo analyse van zebravis infectie 19,35.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Werk in de SM laboratorium wordt ondersteund door een Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella’s ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4 (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4 (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. , (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. , (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).

Tags

Shigella FlexneriAutophagyCytoskeletonActinSeptinCell Autonomous ImmunityZebrafish

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image