使用<em>フレクスナー赤痢菌</em>オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

1組織培養細胞を用いてインビトロでオートファジーと細胞骨格の監視 Sを準備するフレクスナー プレートS.コンゴレッドトリプシンカゼイン大豆（TCS）寒天プレート上へのCグリセロールストック-80℃から赤痢菌 M90T（野生型）。 37℃で一晩インキュベートする。同じプレートは、いくつかの実験のために使用することができる。 個別のコロニーを採取し、37℃で一晩シェーカーで8ミリリットルTCS培地中で成長する。 注：コンゴ – レッド結合は、病原性プラスミドが保持されていることを示しています。 指数関数的な成長のための細菌を継代培養するために、80分の1希釈で一晩細菌培養新鮮TCSに接種し、= 0.3-0.6 600に OD 37℃でシェーカー内で成長する。 5分間千×gで細菌のサブカルチャーをスピン。 5分間千×gで、MEMと遠心でペレットを洗浄。 = 0.3-0.6 600に ODするMEM中でペレットを再構成する。 HeLa細胞のCeを準備感染のLLS 「完全培地」、 すなわち HeLa細胞を成長させ、MEMプラスL-アラニル-L-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸溶液、及び10％ウシ胎児血清を補充した。 実験を開始する前に、6ウェルプレートで24〜1.5×10 5個の細胞または48時間プレート。ガラス顕微鏡用6ウェルプレート中のカバースリップ、または35mmのガラスボトムディッシュ上でプレート上のプレートは、ライブイメージングのために作製した。 注：（。 例えば、アクチンテイル、セプチンケージ）、オートファジーに従うために（ 例えば 、ATG8 / LC3 +はオートファゴソームをVE）と細胞骨格のダイナミクスをリアルタイムでライブイメージングを用いた赤痢菌感染の間、組織培養細胞は一過性にGFP-を使用してトランスフェクションすることができる、 RFP-またはCFP-タグ作成物（説明を参照）。 感染 100で細胞を感染させる： 赤痢菌 （OD 600 = 0.3から0.6）の感染の1多重度（MOI）MEMで希釈した。直接6-WにプレーティングしたHeLa細胞に追加2ミリリットルのMEM（血清飢餓状態）での感染前に48時間（1.2節で説明したように） – エルプレート24。 室温で10分間、700×gで細胞を遠心細菌および宿主細胞に細菌付着を最大にする。遠心分離後、37℃、5％CO 2で30分間インキュベートし、感染を進行させる。 実験に応じて1〜4時間（50μgの/ mlの、細胞外細菌を除去するために）新鮮なMEMで二度感染した細胞を洗浄し、完全培地を含むゲンタマイシンをインキュベートする。 顕微鏡用の感染HeLa細胞を固定およびラベリング 1×PBSで2回感染した細胞を洗浄し、室温で1×PBS中の4％パラホルムアルデヒドで15分間固定してください。パラホルムアルデヒドを除去するために、洗浄細胞を1×PBSで2倍。 室温で10分間、50mMの塩化アンモニウム中で固定した細胞をインキュベートする。 1×PBSで1回洗浄し、室温tにおける0.1％のオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物で4分間、細胞を透過emperature。 注：そのようなサポニンまたはメタノールなどの透過処理のためのエチレンオキシド縮合物をオクチルフェノールする代替方法は、細胞構造20の別の保存のために適用することができる。 で（1×PBS中で細胞を洗浄し、30分間（ 例えば 、P62 / SQSTM1）またはセプチン細胞骨格（SEPT2、SEPT6、SEPT7、SEPT9、およびSEPT11はHeLa細胞で発現している）、オートファジーの重要なコンポーネントに対する一次抗体を用いた湿式チャンバー内でインキュベート4ºCで一晩室温）（）。 （4℃で）一晩（室温で）30分間、ファロイジンで繊維状アクチン（F-アクチン）を1×PBSで2回細胞を洗浄し、二次抗体を用いた湿式チャンバー内でインキュベートし、ラベルを付けます。宿主の染色のために細胞核は4 '、6 – ジアミジノ-2 – フェニルインドール（DAPI）を加える。 1×PBS中で細胞を洗浄し、封入剤を使用してスライドにカバーガラスをマウントします。 感染HeLa細胞の顕微鏡イメージング画像へのinfected細胞はDAPIで標識された赤痢菌を特定するために、落射蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100X対物レンズを使用しています。 注： 図1Aに示すように- 1C、セプチンケージ様構造リングとして可視化することができる、直径〜0.6μmで、7,8アクチンを重合するとオートファジーのマーカーを募集し（ 例えば 、P62およびLC3）の細胞質ゾルの細菌を囲む。これとは対照的に、アクチンテイルを重合する細菌はセプチンケージによって区分されず、オートファジー7,8をターゲットにされることはありません。 エピ蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100Xの対物レンズを使用して、顕微鏡視野当たりの細胞内細菌の数を定量化する。またセプチンケージに閉じ込められた細菌数を定量化し、オートファジーをターゲットに、またはアクチンテイルを重合し、オートファジーをエスケープ。 セプチンケージまたは重合するアクチンテイルに捕捉された細菌の割合を決定するために、infeのZスタック画像列を取るCTED細胞、プロセスのイメージと、少なくとも3つの独立した実験から、実験あたり少なくとも500〜1,000細菌を数える。 オートファジーとインビトロで細胞骨格の2機能解析 NOTE：遺伝的および薬理学的アプローチの両方は、感染組織培養細胞中にオートファジーを摂動するために使用することができ、かつ、感染の経過におけるこれらの治療の影響を監視することができる。 siRNA媒介サイレンプレートの完全培地中、6ウェルプレート中のカバーガラス上に0.8×10 5 HeLa細胞。 オートファジーおよび/または細胞骨格マーカーに対するsiRNAで脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して、次の日にトランスフェクト。 1.3節で説明したように、インキュベーションの所望の期間が経過した後、 赤痢菌で細胞を感染させる。 修正して、1.4節で説明したように細胞を標識する。 薬理学的処置<br />注：細胞骨格を薬理学的に操作することができ、 たとえば 、微小管を脱重合すること、アクチン細胞骨格用サイトカラシンDまたはラトランキュリンBを解重合させるアクトミオシンアクティビティ用ブレビスタチンをブロックする、またはセプチン組立用forchlorfeneuronを破壊するために、ノコダゾールを使用します。オートファジーは、ラパマイシンを使用することによって刺激されまたはバフィロ使用することによってブロックすることができる。 1.3節で説明し、細菌が細胞に入り、細胞質ゾルへのファゴソームから脱出するための十分な時間を許す限り赤痢菌感染時に細胞骨格を操作するには、まず（ 例えば 、> 1.5時間後に感染症） 赤痢菌で細胞を感染させる。 5 M（サイトカラシンD、ラトランキュリンB、ノコダゾール）、20 M（forchlorfeneuron）または50 M（ブレビスタチン）の最終濃度までMEMの[ジメチルスルホキシド（DMSO）中に懸濁原液]ストック溶液からの薬物を希釈し、そして細胞を37℃で30分間処理する。薬物の総量のDMSO（容量/ Dラグ混合物）は、細胞のプレート/バイアル当たりに添加培地2ml当たり1-5液（原液に応じて）である。ネガティブコントロールとして、MEM中に希釈し、DMSOの同様の用量で細胞を処理する。 修正して、1.4節で説明したように細胞を標識する。 注：（感染または非感染細胞内での）オートファジーフラックスの操作については、12時間に4からラパマイシン（20 nM）を、またはバフィロ（160 nM）を用いて、薬物治療を延長する。 ウエスタンブロット法注：オートファジー活性は、p62からとLC3としてオートファジーマーカーのタンパク質レベルを測定することによって定量することができる。 インキュベーションの所望の期間が経過した後、免疫ブロッティングのために細胞を収集し、溶解。 8、10、または14％アクリルアミドゲル上で実行してタンパク質抽出物。 オートファジーフラックス、 すなわち 。 21,22で説明したように、オートファジーの速度が、分析することができる。 顕微鏡イメージングと定量化落射蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100Xオブジェクトの使用IVEは、 シゲラ感染に対するsiRNAの作用または薬物治療は、定量的顕微鏡検査によって評価することができる（ すなわち 、オートファゴソーム、セプチンケージおよびアクチンテイルのカウント）のセクション1.5に記載され、図2Aおよび図2Bに示すように、 Sのin vivoイメージング 3。オートファジーと細胞骨格との相互作用フレクスナー 注： 赤痢菌感染症のゼブラフィッシュモデルは、生体内 19 にセプチンのケージやオートファジーを調査するために使用することができます。 Sを準備するフレクスナー 文化S. 1.1節で説明したようにフレクスナー 。 OD 600 = 0.3〜0.6、10分間、1,000×gでスピン8ミリリットル細菌の継代培養時。 10分1,000×gで1×PBSで遠心分離してペレットを洗浄。 〜2000細菌/ NLを得るために、0.1％のフェノールレッド×PBS中の80μlの中でペレットを再懸濁。 BACTキープ成長を遅くする氷上でerial準備。 注：フェノールレッドを追加すると、幼虫に注入する際の接種物を視覚化するのに役立ちます。 注射用ゼブラフィッシュ幼生を準備注：ゼブラフィッシュは、それらが幼虫呼び出されたときに、卵のようにレイアウトされ、72時間後に受精するまでの胚として識別されます。 （つまり、生成された卵を食べてから、成人を防ぐことができます）ビー玉で覆われた底部を有する独立した水槽には、（1比率は、通常2）4人の男性と8人の女性を配置することによってWesterfield 23で説明したように、成人のゼブラフィッシュを飼育。代わりに、前の晩飼育槽の内側に採卵バスケットを置く。 注：卵はライトがゼブラフィッシュ施設23で上に行く、とすぐにカビの成長を抑制することができるように収集する必要があります〜30分後に受精されている。採卵バスケットは、それらが容易に採取することができるように卵を収集し、また大人から卵を保護するのに役立つ。 胚を収集sおよび10分間の0.003％の漂白剤で胚のメディア（E2）で洗浄することにより、それらをきれいに。胚E2培地で5倍の洗浄、漂白剤でE2を削除し、28℃で10センチメートルシャーレ（100胚/ 50ミリリットルのE2培地）中の胚を成長させる。 胚または幼虫は、24時間後の受精において、顕微鏡研究のために使用される場合はメラニン化を防止するために、E2培地に0.003％N-フェニルチオ尿素を加える。正常な発達のために28ºCで胚を保管してください。 注：ゼブラフィッシュの幼虫は、72時間後に受精における感染の準備ができている。 感染や顕微鏡検査の手順については、E2における200グラム/ mlのトリカインでゼブラフィッシュの幼虫を麻酔。 静脈内および局所感染のためのゼブラフィッシュ幼生の調製注：尾静脈注射を行い、 赤痢菌感染中ゼブラフィッシュの生存を評価する。 赤痢菌にセプチンとオートファジーのマーカーの動員を可視化するために、そのような尾の筋肉のような局所的な部位での感染を行う。 尾静脈内注射のために、針が直面している背側横方向に麻酔した幼虫を置きます。 図3（a）に示すように、尾静脈を目指し、泌尿生殖器の開口部に針先端に近い（後方）を配置し、皮膚を貫通し、目的の細菌の量（注入量1-5 nl）を提供します。 注：静脈内感染は、実行するために挑戦しているし、この手順に慣れるためのトレーニングの数週間かかります。訓練のための（細菌なし）フェノールレッドを注入すると、適切に注射部位を評価するために役立ちます。 NOTE： 赤痢菌の場合には、用量依存性の実験は、低用量の感染症（<千CFU）は、48時間以内にクリアされ、高用量の感染（> 4,000 CFU）は、48時間19以内の死亡をホストにつながることを示している。 セクション3.3.1で説明したように、尾の筋肉の感染のために、麻酔した幼虫を配置します。 図3Aに示されるように、針気をつけて配置する筋肉の体節（ すなわち 、骨格筋のセグメント）にわたってy及び細菌調製物の少量（ すなわち 、1 nl）を注入する。 幼虫中の細菌の静脈注射 24で説明したようにホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリーを引き出します。 三次元粗マニュアルマニピュレータのホルダーに針を接続し、細いピンセットで針の先端を破る。 針をロードするには、カバーガラス上に細菌培養の低下を置く。ややドロップに針の先端を浸し、マイクロインジェクター、ガスシリンダーに切り替え、細菌調製物の所望の量の針を埋める。 注入量を較正するために、カバースリップ上の鉱物油の滴を置き、細菌調製物を注入する。マイクロメーターを用いて液滴の直径を測定し、注入量を計算[V =（4/3）πR3]。 注：bacteriで注射を40psiの設定と50ミリ秒を使用した3.1節で説明したように他の準備はNL〜2000 CFU /を与える。 Westerfield 23で説明したように、プラスチック金型を用いて射出プレートを準備します。 注入プレートに幼虫を移し、細い絵筆を使用してそれらを並べる。オリエントとセクション3.3.1で説明したように幼虫を注入する。 ゼブラフィッシュ生存率の評価のために、/ウェルE2 1mlの24ウェルプレートに個別に感染した幼虫を移し、28℃でインキュベートする。時間（ 図3B）にわたって毎日次の2-5日とプロットの生存のために感染した幼虫を監視します。 細菌の定量化のためのゼブラフィッシュの幼虫めっき注：汚染を避けるために無菌フード下で働く。 （時間0時間の感染後に）、必要な時点で細菌の定量化のために、魚に注入細菌数を評価するために、トリカインの過剰摂取（200〜500 mg / Lの）でゼブラフィッシュの幼虫を生け贄に捧げる。 1.5ミリリットルのPOLに個別の幼虫を置きます0.1％のオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物1×PBSを200μlとypropyleneマイクロ遠心チューブと機械的に乳棒を用いて均質化する。 注：、注入量に細菌負荷を確認するの滅菌1×PBS降下に等しい線量をポンプし、それをプレートに。 寒天プレート溶原性ブロス（LB）上に滅菌水やプレート内のゼブラフィッシュ幼生ホモジネートの段階希釈を作る。幼虫は、病原性プラスミドを維持したりしないた赤痢菌を区別するためにコンゴレッドTCSプレート上に交互にめっきすることができる。 注：感染のために使用ゼブラフィッシュ幼生の状態をチェックするための制御として、プレート3以上の非感染魚。 37℃でプレートを一晩インキュベートした後、細菌コロニーを数える。 図3Cに示されるように、対数スケールを用いて表す。 NOTE：ゼブラフィッシュの幼生の感染中の細菌負荷はまた、蛍光標識された赤痢菌および顕微鏡私を使用して視覚化することができるセクション3.7または3.8（ 図3D）に記載されているようmaging。 ゼブラフィッシュ幼生免疫染色希望の時点で、トリカインの過剰摂取を使って幼虫を生け贄に捧げる。 1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心チューブ（10〜20幼虫/チューブ）で魚を集める。 （4℃で）2（室温）時間または一晩（幼虫クラスタリングを回避するために）1×PBS中に0.4％オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、4％パラホルムアルデヒドを使用して、幼虫を修正し、軌道攪拌機中でインキュベートする。 注：電子顕微鏡法は、感染したゼブラフィッシュの幼生の超微細構造の分析のために使用することができる。この場合、麻酔をかけた胚はMostowy ら 19に従って固定され、処理されるべきである。 5分間1×PBS、0.4％オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物での洗浄3回、次に室温で1時間（1×PBS中の10％ウシ胎児血清、1％DMSO、0.1％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）をブロッキング溶液でブロックする。 ディブロッキング溶液中で一次抗体をリュート。希釈した一次抗体に幼虫を追加し、軌道攪拌機中で4℃で一晩インキュベートする。セクション1.4.3に上記のような一次抗体を使用してください。 室温でのPBS 1×0.1％のポリオキシエチレンモノラウレートでの15分間の幼虫の4倍を洗ってください。 ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈する。希釈された二次抗体に幼虫を追加し、軌道攪拌機中で4℃で一晩インキュベートする。セクション1.4.4で説明したのと同じ二次抗体およびファロイジンを使用してください。 室温でのPBS 1×、0.1％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウにおいて15分間洗浄する4倍速。宿主細胞の核の染色のために、これらの15分間の洗浄の最初の中にDAPI（150nMの最終濃度）を加える。 蛍光標識された幼虫の保全のために、15、30、60のグリセロール勾配中で漸進的にそれらをインキュベートし、80％は室温気性で2時間、1×PBSおよび0.1％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（中に希釈ature）（）4℃で一晩に。 注：染色した幼虫は長期間保存することができる、4℃で80％グリセロール中で（ 例えば 、4ヶ月）。 固定ゼブラフィッシュ幼生の顕微鏡イメージング 35ミリメートル（実体顕微鏡用）ペトリ皿または（共焦点ミスコピーのために）完全なガラスボトムディッシュに80％グリセロールの小滴に固定されたグリセロール埋め込み幼虫を転送します。 感染した幼虫のZスタック画像列を取り、必要に応じて画像を処理。 落射蛍光または共焦点顕微鏡および生物全体のイメージングのための10倍または20倍対物レンズを使用してください。その後、個別の細胞や生体内 19 内の個別の細菌にオートファジーと細胞骨格マーカーの募集（図4Aおよび4B）を可視化するために、共焦点顕微鏡および40X、63X、または100X目標を使用しています。 注：尾の筋肉に魚に感染し、EAを可能にするためにガラスボトム皿の底に沿って平らなグリセロールにマウントSY焦点。 感染ゼブラフィッシュ幼生の顕微鏡イメージングは​​、ライブ注：幼虫は、このように生体内でのオートファゴソームは、GFP-LC3ゼブラフィッシュトランスジェニック系統25を用いて可視化することができ、光学的にアクセス可能です。 3.3節で説明したようにゼブラフィッシュの幼虫に感染し、このセクションで説明するようにマウントします。 E2に低融点1％アガロース（LMA）を準備し、幼虫の損傷/殺害を避けるために、35〜37℃に冷却する。 35ミリメートル（実体顕微鏡用）ペトリ皿または（共焦点顕微鏡用）のフルガラスボトムディッシュにLMAの滴を配布します。 転送がLMAに（可能な限り少量の水で）個別にゼブラフィッシュの幼虫を麻酔し廃棄します。絵筆を用いて所望の位置にオリエント幼虫と凝固するアガロースを待つ。 LMA、およびE2は乾燥から準備を回避するために、水から酸素を交換するために魚を可能にするために200μg/ mlのトリカインを含むとオーバーレイ全体食器表面を覆う。 落射蛍光または共焦点顕微鏡全体ゼブラフィッシュの幼虫を画像化するための10倍または20倍対物レンズを使用してください。 生体内で （ すなわち 、GFP-LC3 +は赤痢菌の周囲の液胞をVE）細菌authopagosomesを可視化するために、共焦点顕微鏡および40X、63X、または100X目標を使用してください。 （ 例えば 、いくつかの時間かけて2分ごと）を時間をかけて、感染した幼虫のZスタックを取るリアルタイムで、オートファゴソーム、及びそのダイナミクスを可視化する。 オートファジーおよびin vivoでの細胞骨格の4機能解析注：感染の経過におけるオートファジーの薬理学的および遺伝的摂動の影響は、全体の動物のレベルで監視し、単一細胞のレベルですることができます。 モルホリノ注入によるオートファジー操作 10分間65℃に加温して1 mMのストック溶液を滅菌水中モルホリノオリゴヌクレオチドを​​再構成する。店室温で加えた。 注：モルホリノオリゴヌクレオチドの注射は1-4細胞期の胚で実行する必要があります。 ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水の滅菌0.1％フェノールレッドとモルフォリノオリゴヌクレオチド作業溶液を調製します。セクション3.4.2で説明したように針をロードします。セクション3.4.3で説明したように、モルホリノ、オリゴヌクレオチド注入量を校正することができる。 注：フェノールレッドは、注入量を視覚化するのに役立ちます。 胚ポジショニング室（ すなわち 、部分的に除去針に面したエッジを持つ10センチメートルペトリ皿の蓋の上にシアノアクリレートで接着顕微鏡スライド）を準備します。少量の水でチャンバーに1-4細胞期の胚を移し、細い絵筆でそれらを合わせます。 絨毛膜とスムーズに卵黄を貫通している。中に入ると、モルホリノオリゴヌクレオチド溶液の所望の体積を注入するためにペダルを踏む。 注：0.5に注射の量を最小限に抑える – 2 NL;ボリュームは高いTHAnは5ナノリットルの発達障害を引き起こし、卵の死亡率を増加させることができる。 マイクロインジェクション後、きれいな胚（3.2節で説明したように漂白することによって）と28℃でのE2とペトリ皿で​​それらをインキュベートする。 72時間後の受精制御に感染する（ すなわち 、コントロールモルホリノオリゴヌクレオチドを注入したゼブラフィッシュの幼虫）またはP62のモルファント（ すなわち 、P62のホリノオリゴヌクレオチドを注入したゼブラフィッシュの幼虫）のセクション3.4に記載されているように赤痢菌と。 3.5節で説明したように、次の2〜5日間、生存及び細菌負荷を評価する。 3.7節で説明し、 図4（c）にハイライト表示、またはセクション3.8で説明したように、画像ゼブラフィッシュの幼虫を生きたような画像は、ゼブラフィッシュの幼虫を修正しました。 注：有効なモルホリノオリゴヌクレオチドの用量は（考察を参照）転写スプライシングまたはタンパク質翻訳を阻害するその効率に基づいて評価することができる。