In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

! ATENÇÃO: Este protocolo envolve o uso de lasers da classe 3B e exigirá diretrizes de treinamento e segurança adequados a serem seguidos. Óculos de segurança deve ser usado em todos os momentos ao operar lasers, com procedimentos de alinhamento apresentando um risco particularmente elevado. Contactar o fornecedor de laser para determinar os óculos que irão proporcionar a atenuação máxima para um dado laser. Se estiver disponível, se inscrever em um curso de treinamento de segurança a laser institucional. Nunca utilize um laser sem o óculos de segurança e treinamento adequados. 1. Laser Aparelho Set-up Se for caso disso, os passos na secção 1 são designados como (A) ou (B) para diferenciar entre os sistemas de laser simples ou dupla, respectivamente. Anexar e garantir lasers à placa de ensaio. Breadboards são excelentes condutores de calor e agir como um dissipador de calor para evitar danos aos componentes internos do laser com o uso prolongado. (A) Fixar a pré-las acopladoer a um 10 "x 12" placa de ensaio (ou como necessário) usando ¼-20 "parafusos de fixação e as anilhas (Figura 2A). Se os furos breadboard não se alinham com os furos de montagem do laser, usar pequenas 'grampos de mesa' para garantir a laser para breadboard. (B) Se os dois lasers a utilizar têm muito diferentes alturas do feixe (> ~ 1 cm), use pequenas 4 "x 6" breadboards para criar uma plataforma para um dos lasers. Anexar estas placas para as principais grandes 12 "x 18" placa de ensaio usando ¼-20 "parafusos de fixação com arruelas, em seguida, anexar o laser para as placas menores usando parafusos de fixação ou grampos de mesa, como mostrado na Figura 2B. Fixe o outro laser diretamente à placa de ensaio usando parafusos de fixação ou uma variável grampo de mesa altura. Passo Crítica: Breadboards, parafusos e componentes ópticos podem ser adquiridos como imperial ou métrica que assim seja consistente na compra de itens; o padrão para este protocolo é imperial. (A)Anexar uma espessura de jaqueta-se apegam flat / contato físico (FC / PC) patch cord ao acoplador (referido como um cabo de engate; veja a Figura 3) que está fisicamente conectado à frente do laser (Figura 2A). (B) Passe o acoplador para um ¾ "post óptica, então epóxi a articulação entre o acoplador e o topo do poste usando JB Kwik, ou epóxi semelhante, para evitar o afrouxamento e desalinhamento durante o uso. Fixe o correio para o placa de ensaio (como os buracos breadboard nem sempre se alinham com a colocação necessária de componentes ópticos, um investigador, adaptador de base de pedestal, e aperto garfo são usadas para proteger pós óptica do acoplador no lugar). Conecte um cabo de manobra de espessura de jaqueta (cabo de acoplador) para a parte de trás do engate. (B) Insira o primeiro espelho de orientação para o laser azul no suporte cinemática, e anexá-lo à placa de ensaio usando um ¾ "post óptica. Fixe este post para uma base de adapTer e fixação do garfo. Posicione o garfo de fixação e montagem postar diretamente na frente do laser azul com espelho inclinado a 45 ° para dirigir o laser em direção ao espelho dicróico. Use o padrão de grade de furos na placa de ensaio como um guia de alinhamento áspera. Uma vez que aproximadamente posicionado, use um parafuso ¼ "-20 tampa para proteger o garfo de fixação à placa de ensaio (ver Figuras 2B, C). (B) Insira o espelho dicróico em um suporte de cinemática e anexá-lo a um "post óptica 1 e garantir diretamente à placa de ensaio. Posicione o espelho dicróico para a extrema esquerda de, e de acordo com, o espelho de laser azul. Ângulo do espelho dicróico em um ângulo de 45 ° de tal modo que a luz azul refletida fora do primeiro espelho é refletido no acoplador, em seguida, aperte o parafuso de fixação do titular cinemático para o cargo (ver Figuras 2B, C). (B) Fixe o primeiro espelho de direção para o laser amarelo a um ¾ "post óptica. Fixe o optical post para um adaptador de base e de fixação do garfo. Posicione o garfo de fixação e de pós-conjunto em frente do laser amarelo e ângulo do espelho em um ângulo de 45 ° tal que a luz amarela será direcionada para o segundo espelho de direção. Prenda o garfo de aperto no lugar com um ¼ "-20 parafuso e uma arruela. (B) Fixe o segundo espelho de direção para o laser amarelo a um "post óptica 1. Ângulo do espelho de modo a que o feixe de luz amarela a partir do primeiro espelho irá ser reflectida através da dicróico e no acoplador (Figura 2C). Prenda o pós diretamente ao placa de ensaio e aperte o parafuso de montagem uma vez que o espelho é inclinado de forma adequada. Ajustes espelho Belas será feita usando as montagens espelho cinemáticas em uma etapa posterior. (B) Anexar uma roda de filtro de densidade neutra para uma ¾ "post óptica e colocar o cargo em um suporte pós ligado a uma base de montagem. Fixe o conjunto da placa de ensaio entre o primeiro e seespelhos amarelo cond usando um único ¼ "-20 parafuso. Esta roda é usada para ajustar a energia de luz laser amarelo atingindo o acoplador. Dica: Individualmente aperte todos os componentes (como os parafusos que prendem os titulares espelho cinemáticas para o início de posts, e os fios que prendem adaptadores de base para o fundo de posts) antes de anexá-los à base. Use um veio de uma pequena chave sextavada nos fornecido através de-buracos em postos ópticos para obter torque suficiente. Isso vai evitar que os componentes se soltar durante o uso, necessitando de realinhamento. Anexar um FC / PC para PC / adaptador de suporte em L FC para a placa de ensaio. Opcional: Garantir um 1 x 2 50/50 mini-fibra cubo divisor directamente para a placa de ensaio para utilização simultânea estimulação in vivo de dois ou mais animais. Além disso, os cabos podem ser adicionadas para facilitar o movimento do conjunto de placa de ensaio (como visto na Figura 2A). 2. Laser Coupling (sem contato Estilo Coupling) Esta seção refere-se a dupla laser-set-up (Figura 2B). Alinhe o caminho laser azul interior antes de alinhar o caminho laser amarelo exterior. ! CUIDADO: Use um baixo consumo de energia de acoplamento da luz (~ 1 mW) para garantir a segurança dos olhos. Use óculos de segurança para ligar o laser e até a intensidade da luz é medida e considerados seguros. Definir os interruptores na parte de trás do laser para "Curr" (corrente) e modo de transístor-transístor lógica (TTL) + para a iluminação constante (como oposto para o modo analógico). Certifique-se de que o botão de energia na frente do condutor é fixado em zero. Ligue o laser ligando o piloto de primeira e, em seguida, a tecla de laser. Ajuste lentamente o botão de alimentação localizado na parte frontal do controlador de laser para que ~ 1 mW luz laser está sendo emitida. Aguarde 10 – 15 minutos (ou conforme especificado pelo fabricante) para o laser para aquecer. Conecte o cabo de fibra óptica testador diretamente para a free final do patch cord acoplador e ligue o testador de cabo (Figura 3A). Ajustar o ângulo do acoplador, de modo que o feixe de vermelho viaja em linha reta de volta em direcção ao centro do espelho dicróico. O caminho do feixe de luz vermelha emitida a partir do testador de cabo é o caminho exacto que a luz do laser de entrada precisará seguir a fim de ser acoplado para o laser. Faça o alinhamento grosseiro: Use os botões laterais e horizontais nos espelhos cinemáticas para dirigir o feixe de luz do laser para o acoplador. As braçadeiras de pedestal pode precisar de ser ligeiramente afrouxado para reposicionar os espelhos e o acoplador. As montagens cinemáticas ainda deve ter algumas viagens disponíveis para mais ajustes finos. Não se preocupe se não houver luz azul está sendo emitida fora do patch cord anexado-acoplador neste momento. Coloque um único pedaço de papel semi-translúcido diretamente na frente do espelho dicróico, entre o dicróicas e acoplador. Haverá tanto um azul e ared ponto neste papel do laser e do testador de cabo, respectivamente. Utilize papel que é translúcido o suficiente para ver tanto os pontos vermelhos e azuis simultaneamente a partir do mesmo lado do papel. Faça ajustes finos para o primeiro espelho da direcção (ou seja, aquele mais próximo do laser, não o dicróicas), ajustando cuidadosamente os botões laterais e horizontais para alinhar o centro do ponto vermelho com o ponto azul. Mover o papel para trás para o acoplador de modo a que seja directamente em frente do acoplador e ajustar os botões no segundo (isto é, dicróico) espelho para alinhar o feixe de laser com o feixe de vermelho. Iterar os passos 2.6 e 2.7 até que o centro das vigas azul / amarelo e vermelho são exactamente alinhadas em ambas as posições (isto é, até que os feixes vermelhos e azuis são colineares). Retirar o testador cabo do cabo do acoplador. A luz do laser deve agora ser emitida a partir da extremidade do cabo de remendo acoplador. Determine eficiência de acoplamento através da medição da energia de luz emitida a partir da ponta da fibra do acoplador de cabo de remendo usando um medidor de potência. Use a configuração de 500 mW em fotodiodo do medidor de energia e alterar a configuração de (λ) de comprimento de onda para o azul (473 nm) ou luz amarela (635 nm) espectro dependendo o laser a ser utilizado. Colocar a ponta da fibra perpendicular ao fotodiodo para obter uma leitura de potência. Comparar a energia de luz que entra no acoplador, para a energia de luz emitida a partir da extremidade da fibra. A eficiência de acoplamento de> 80% é considerado muito bom. Muito pequenos ajustes na segunda espelho de orientação às vezes pode melhorar um pouco acoplamento. Em geral, quando o padrão de feixe a partir da extremidade da fibra de ligação é apertado um pequeno ponto central (sem anéis que o rodeiam), a eficiência de acoplamento para dentro do núcleo da fibra é óptima. Repita os passos 2,1-2,11 para acoplamento laser amarelo, exceto usar os dois espelhos de direção para o laser amarelo (veja a Figura 2C). Será que nãot ajustar a posição do espelho dicróico ou alinhamento do laser azul será perdido. 3. Estimulação in vivo Optogenetic Certifique-se de que quaisquer procedimentos que envolvam o uso de animais são conduzidos de acordo com as diretrizes locais e nacionais e aprovado pelo correspondente Institutional Animal Care e do Comitê Use. Fibra óptica set-up (ver Figura 3B para a identificação dos diferentes tipos de cabos de remendo referido abaixo). Para estimular um único mouse, conecte o cabo de manobra de acoplamento a um cabo de correção de espessura de jaqueta usando o / FC adaptador de suporte em L FC diretamente ligado à placa de ensaio (ver Figura 4A). Para estimular a dois animais de um laser, conecte o cabo de manobra de acoplamento para dois cordões grossos de jaqueta usando o 1 x 2 50/50 mini-cubo (veja a Figura 4B). Para estimular a três ou mais animais, conecte o cabo de acoplador para um divisor de fibra multimodo usando o 1 x 2 mcube ini já anexado à placa de ensaio (ver Figura 4C). Anexar um comutador / junta rotativa para as extremidades livres do splitter remendo cabo / fibra de espessura de jaqueta. Comutadores são essenciais, pois permitem a rotação da fibra com o movimento do roedor, o que impede o acúmulo de torque no cabo de manobra. Demasiada binário pode torcer cabos de, levar à ruptura, e interferir com o movimento natural do animal durante o ensaio. Conecte o cabo de remendo animal para o comutador. Anexar uma manga de divisão de ligação para o final de metal ponteira livre do cabo de remendo do animal (Figura 5). Não force a manga de todo o caminho até a ponteira; deixar ~ 0,5 cm da manga exposto como este é o que se conecta à fibra óptica implantado afixada ao animal (Figura 6). Passo Crítica: Sempre comprar mangas que contêm uma divisão para permitir a expansão da manga sobre ponteira de fibra implantado durante a ligação eremoção. Muito apertado de um ajuste pode causar trauma grave para o animal se o implante desaloja a partir do crânio ao tentar desconectar a manga do implante. Se isto não ocorrer, o animal deve ser retirado do estudo e recebem cuidados veterinário imediato. Da mesma forma, antes de usar um novo manga, pela primeira vez, "quebrá-lo em 'por ligar e desligar um ferrolho até ele desconecta com a quantidade desejada de força. Tip: É fácil de quebrar uma fibra durante a remoção de uma manga que é rigidamente ligada a um ferrolho. Para evitar isso, empurrar o ferrolho para fora através da inserção de uma pequena haste de madeira dentro da extremidade aberta da manga (o identificador de um cotonete padrão é o tamanho correctos). Conecte o condutor de laser azul para um gerador de pulsos, utilizando um cabo BNC e vire o gerador de impulsos diante. Coloque óculos de segurança apropriadas diante. Definir os interruptores na parte de trás do laser para o modo "Curr" e "TTL +". Certifique-se de that o botão de energia na frente do condutor é fixada em zero andturn o laser (transformar o motorista em primeiro lugar e, em seguida, a tecla de laser). Ajuste o botão de energia na parte frontal do laser de modo a que 5 – 10 mW está a ser emitida a partir da ponta da fibra patch cord animal, tal como medido usando um medidor de energia da luz. 5 – 10 mW é uma orientação geral – a intensidade de potência exacta requerida para afectar um dado volume de tecido deve ser calculada antes do início da experiência, tal como no Aravanis 3 et al. Desligue o laser azul para o modo "Analog" in vivo para estimulação. Nota: lasers DPSS amarelas são operados em TTL + modo de iluminação constante. Aguarde 10-15 min para o laser para aquecer. Gentilmente restringir o mouse e conecte a manga de divisão no patch cord animal para a fibra implantável crônica (ver Figura 6). Certifique-se as extremidades das duas fibras fazer contato físico com o outro. Use a divisão na manga de ligação como umjanela para visualizar o contato direto entre os dois Passo Crítica:. Às vezes, os restos podem acumular-se na ponteira de metal de fibra implantável do animal e interferir com a conexão adequada. Neste caso, use um etanol limpar para limpar suavemente a ponteira sobre a cabeça do animal antes da fixação. Nunca force uma manga de ligação por cima da ponteira pois isso pode causar trauma grave para o animal. Se uma conexão física entre extremidades da fibra não pode ser feita após a limpeza, remover o animal do estudo. Dica: o vazamento de luz pode ocorrer no ponto de conexão entre a fibra e animal patch cord implantado. Visualization dessa luz por roedores pode apresentar uma confundem experimental 10. Calor psiquiatra tubulação pode ser anexado ao patch cords e deslizou sobre o ponto de conexão para minimizar a luz parasita. Permitir que o rato para recuperar durante alguns minutos antes do início do teste de comportamento. Dica: Depending no teste comportamental a ser administrada, é melhor se que se habituem ratos para o processo de ligação e amarrar 2 – 3 dias antes, como a manipulação necessária para ligar o animal pode induzir stress e confundir os ensaios de comportamento. Posicione o mouse no aparelho de testes comportamentais garantindo que o cabo do conector está livre de dificuldades. Nunca deixe um animal sem vigilância durante a estimulação. Mesmo com a utilização de comutadores, cordões têm tendência a torcer durante períodos de tempo prolongados e podem interferir com os ensaios de comportamento. Use um gerador de pulso a pulso do laser azul com uma frequência pré-determinada que ativará opsina de escolha. Para o uso do laser amarelo: pulsar o laser amarelo com persianas externas ou simplesmente bloqueando o caminho do feixe com um não-reflexivo objeto opaco, e não inflamável. 4. Pós in vivo Considerações Estimulação Esta secção não se destina a ser um proto completacol, mas é oferecido como orientação para procedimentos adicionais que devem ser considerados seguinte in vivo estimulação optogenetic. Após a conclusão de um experimento, confirmar viral e fibra histologicamente colocação para a interpretação precisa dos resultados comportamentais. Eutanásia dos animais de acordo com as orientações institucionais e perfundir o animal com solução salina gelada tamponada com fosfato (PBS) e 4% (w / v) de paraformaldeído em PBS. Remover implantado fibra óptica, segurando firmemente a ponteira de metal exposto com um alicate ou hemostats. Suba em um liso, ainda rápido, movimento. É importante para testar a integridade da fibra implantado medindo a emissão de luz no final de cada experiência. Post-fixar os cérebros em paraformaldeído por pelo menos 24-48 horas antes do corte através da região de interesse. (Se estiver usando um micrótomo de congelação, incubar cérebros em uma solução de sacarose 30% durante vários dias antes do corte). Execute imunohistoquímica usando standard protocolos para a detecção dos fluorophores marcado com opsina adequadas, ou seja, a proteína verde fluorescente (GFP), o reforço da proteína fluorescente amarela (EYFP) ou mCherry. Consulte o site de expressão opsina e implante de fibra sob um microscópio e visualmente confirmar o posicionamento adequado de injeção de vírus e implante com base em coordenadas escolhidas.