In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

! LET OP: Dit protocol omvat het gebruik van de klasse 3B lasers en zal juiste richtlijnen opleiding en veiligheid moeten worden gevolgd. Veiligheidsbril moet gedragen worden ten alle tijden bij het bedienen van lasers, met de aanpassing procedures presentatie van een bijzonder hoog risico. Neem contact op met de laser provider om de brillen die maximale demping zal zorgen voor een gegeven laser bepalen. Indien beschikbaar, inschrijven in een institutionele laserveiligheid-opleiding. Exploiteren van een laser nooit zonder de juiste oogbescherming en opleiding. 1. Laser Apparatuur Set-up In voorkomend geval, zijn stappen in hoofdstuk 1 aangeduid als (A) of (B) om onderscheid te maken tussen enkele of dubbele lasersystemen, respectievelijk. Hechten en veilig lasers om het breadboard. Breadboards zijn uitstekende warmtegeleider en fungeren als een koellichaam om schade aan de interne laser onderdelen bij langdurig gebruik te voorkomen. (A) Bevestig de pre-gekoppelde laser om een 10 "x 12" broodplank (of indien nodig) met behulp van ¼-20 "cap schroeven en ringen (Figuur 2A). Als broodplank gaten niet uitgelijnd met laser montagegaten, gebruik maken van kleine 'tafelklemmen' laser vast te breadboard. (B) Als het 2 lasers te gebruiken zeer verschillende beam hoogtes (> ~ 1 cm), gebruik maken van kleine 4 "x 6" breadboards een platform voor één van de lasers. Bevestig deze borden naar de belangrijkste grote 12 "x 18" breadboard met behulp van ¼-20 "cap schroeven met ringen, bevestig vervolgens de laser om de kleinere planken met behulp van schroeven of tafelklemmen zoals weergegeven in figuur 2B. Maak de andere laser direct op de broodplank met behulp van schroeven of een variabele hoogte tafelklem. Kritische stap: Breadboards, schroeven, en optische componenten kunnen worden gekocht als keizerlijke of metrische consistente dus bij de aankoop van artikelen; de standaardinstelling voor dit protocol is keizerlijke. (A)Bevestig een dikke mantel platte splitsen / fysiek contact (FC / PC) patch snoer met de koppelaar (aangeduid als een snoer van zie figuur 3) die fysiek is bevestigd aan de voorzijde van de laser (figuur 2A). (B) Haal het koppelstuk op een ¾ "optisch post, dan epoxy de verbinding tussen de koppeling en de bovenkant van de paal met JB Kwik, epoxy of dergelijke te voorkomen losmaken en uitlijning gedurende gebruik. Bevestig de post naar de broodplank (zoals de broodplank gaten zal niet altijd op een lijn met de vereiste plaatsing van optische componenten, een ambtsdrager, voetstuk base-adapter, en klemmen vork worden gebruikt om de koppeling van de optische achteraf vast te zetten). Bevestig een dikke mantel patchkabel (koppeling snoer) aan de achterkant van de koppeling. (B) Plaats de eerste stuur- spiegel voor de blauwe laser in de kinematische houder en bevestig deze aan de broodplank met een ¾ "optische bericht. Bevestig dit bericht aan een basis ADAPter en klemmen vork. Plaats de klemmen vork en post montage direct voor de blauwe laser met spiegel onder een hoek van 45 ° met de laser naar de dichroïsche spiegel sturen. Gebruik het rooster patroon van gaten op de broodplank als een ruwe uitlijngeleider. Eenmaal grofweg gepositioneerd, gebruik dan een ¼ "-20 dop schroef aan de klem vork vast te zetten aan de broodplank (zie figuren 2B, C). (B) Steek de dichroïsche spiegel in een kinematische houder en bevestig deze aan een 1 "optische post en veilig direct naar het breadboard. Plaats de dichroïsche spiegel aan de uiterst links van, en in overeenstemming met de blauwe laser spiegel. Hoek van de dichroïsche spiegel in een hoek van 45 °, zodanig dat blauw licht gereflecteerd door de eerste spiegel wordt weerspiegeld in de koppeling, draai de schroef bevestigen van de kinematische houder om de post (zie figuren 2B, C). (B) Bevestig de eerste stuur- spiegel voor de gele laser om een ​​¾ "optische bericht. Bevestig de optical post naar een basis-adapter en klemmen vork. Plaats de klemmen vork en post-ensemble direct voor de gele laser en de hoek van de spiegel bij 45 ° zodanig dat geel licht wordt gericht naar de tweede spiegel stuurinrichting. Bevestig de klemmen vork in plaats met een ¼ "-20 dop schroef en ring. (B) Bevestig de tweede stuurstand spiegel voor de gele laser om een ​​1 "optische bericht. Hoek van de spiegel zodanig dat de gele lichtstraal van de eerste spiegel zal worden weerspiegeld door de dichroic en in de koppeling (figuur 2C). Bevestig het bericht direct naar de breadboard en draai de bevestigingsschroef zodra de spiegel onder een hoek op de juiste wijze. Fijne spiegel aanpassingen worden gemaakt met behulp van de kinematische spiegel mounts in een latere stap. (B) Bevestig een grijsfilter wiel om een ​​¾ "optische post en leg de post in een post houder bevestigd aan een montageplaat. Bevestig het ensemble aan de broodplank tussen de eerste en second gele spiegels met behulp van een enkele ¼ "-20 dop schroef. Dit wiel wordt gebruikt om de kracht van geel laserlicht bereikt de koppeling passen. Tip: Individueel alle componenten (zoals de schroeven waarmee kinematische spiegel houders naar de top van de ambten, en de draden houden basis adapters aan de onderkant van berichten) draai voordat ze aan de basis. Gebruik een schacht van een kleine inbussleutel in de informatie die via-gaten in optische berichten om genoeg koppel te krijgen. Hiermee wordt voorkomen dat onderdelen los komen tijdens het gebruik, noodzakelijk herschikking. Bevestig een FC / PC naar FC / PC L-bracket adapter op het breadboard. Optioneel: Bevestig een 1 x 2 50/50 mini kubus vezel splitter direct naar breadboard voor gelijktijdig in vivo stimulatie van twee of meer dieren. Bovendien kunnen handvatten worden toegevoegd om te helpen bij de beweging van steekbord samenstel (zoals weergegeven in figuur 2A). 2. Laser Koppeling (Non-contact stijl Koppeling) Deze sectie heeft betrekking op de dual-laser set-up (Figuur 2B). Lijn de innerlijke blauwe laser pad vóór het uitlijnen van de buitenste gele laser pad. ! LET OP: Gebruik een laag licht macht koppeling (~ 1 mW) om de veiligheid oog te garanderen. Draag een veiligheidsbril aan de macht van de laser en tot lichtintensiteit wordt gemeten en die veilig worden geacht. Stel de schakelaars op de achterzijde van de laser "Curr" (stroom) en transistor-transistor logic mode (TTL) + voor constante verlichting (in tegenstelling tot analoge modus). Zorg ervoor dat de stroom knop op de voorkant van de bestuurder is ingesteld op nul. Zet de laser instelling door de bestuurder en daarna de laser toets. Langzaam pas de stroom knop aan de voorzijde van het laseraanstuurmiddel zodat ~ 1 mW laserlicht wordt uitgezonden. Wacht 10-15 minuten (of zoals aangegeven door de fabrikant) voor laser op te warmen. Sluit de glasvezelkabel tester direct naar de free einde van de koppeling patch stopcontact en zet de kabel tester (Figuur 3A). Pas de hoek van de koppeling zodat de rode straal reist direct terug naar het midden van de dichroïsche spiegel. De bundel pad van het rood licht uitgestraald door de kabel tester is het exacte pad dat de inkomende laserlicht zal moeten volgen om te worden gekoppeld in de laser. Voer een grove uitlijning: Gebruik de laterale en horizontale knoppen aan de kinematische spiegels aan de laserstraal te sturen in de koppeling. Het voetstuk klemmen moet worden losgemaakt iets herpositioneren de spiegels en de koppeling. De kinematische mounts moet nog wat reizen beschikbaar voor verdere fijne aanpassingen. Wees niet bezorgd zijn als er geen blauw licht wordt uitgezonden uit de koppelaar bevestigd patchkabel op dit moment. Plaats een stuk semitransparant papier direct voor de dichroïsche spiegel, tussen de dichroïsche en koppeling. Er zal zowel een blauwe en ared stip op dit papier uit de laser en de kabel tester, respectievelijk. Gebruik papier dat is doorschijnend genoeg om zowel de rode en blauwe plekken tegelijk zien vanaf dezelfde kant van het papier. Nauwkeurig afstellen de eerste stuurinrichting spiegel (dwz de ene dichter bij de laser, niet de dichroïsche) door voorzichtig aanpassen van de laterale en horizontale knoppen om het midden van de rood punt met de blauwe stip lijnen. Schuif het papier terug naar de koppeling zodat het direct voor de koppeling en de knoppen pas op de tweede (dwz dichroïsche) spiegel voor de laserbundel met de rode balk lijnen. Itereren over de stappen 2.6 en 2.7 tot en met het middelpunt van de blauw / gele en rode balken precies zijn uitgelijnd in beide posities (dat wil zeggen, tot de rode en blauwe balken zijn colineair). Verwijder de kabel tester uit de koppeling snoer. Laserlicht moet nu worden uitgezonden vanaf het einde van de koppeling patchkabel. BEPALIne koppelingsefficiëntie door het meten van het licht wordt uitgezonden vanuit de vezel tip van de koppeling patchkabel met behulp van een power meter. Gebruik de 500 mW instelling op fotodiode de power meter en de golflengte instelling (λ) naar blauw (473 nm) of geel (635 nm) spectrum licht, afhankelijk van de laser wordt gebruikt veranderen. Plaats de vezelpunt loodrecht op de fotodiode tot een macht te bekomen. Vergelijk het licht kracht invoeren van de koppeling aan het licht wordt uitgezonden vanaf het einde vezels. Een koppeling rendement van> 80% wordt als zeer goed. Zeer kleine verdere aanpassingen van de tweede stuurstand spiegel kan soms licht verbeteren koppeling. In het algemeen, wanneer de lichtbundel vanaf het einde van de koppeling vezel is een kleine, strakke, centrale locatie (zonder er omheen), koppelingsefficiëntie in de vezelkern optimaal. Herhaal de stappen 2,1-2,11 voor gele laser koppeling, met uitzondering van het gebruik van de twee spiegels voor de gele laser (zie figuur 2C). Doe geent pas de positie van de dichroïsche spiegel of uitlijning van de blauwe laser zullen verloren gaan. 3. In vivo optogenetische Stimulatie Zorg dat alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale en nationale richtlijnen en goedgekeurd door de overeenkomstige Institutional Animal Care en gebruik Comite. Optische vezel opstelling (zie figuur 3B voor identificatie van de verschillende patchkabels hierna). Om een enkele muis te stimuleren, sluit de koppeling patchkabel tot een dikke mantel patchkabel met behulp van de FC / FC L-bracket adapter rechtstreeks aangesloten op de broodplank (zie figuur 4A). Om twee dieren van de ene laser te stimuleren, sluit de koppeling patchkabel aan twee dikke mantel patchkabels met behulp van de 1 x 2 50/50 mini kubus (zie figuur 4B). Om drie of meer dieren te stimuleren, bevestig het snoer van een multimode fiber splitter met behulp van de 1 x 2 mini kubus reeds aan de broodplank (zie Figuur 4C). Bevestig een collector / rotary joint aan de vrije uiteinden van de dikke mantel flardkoord / fiber splitter. Schakelaars zijn essentieel als ze rotatie van de vezel met beweging van knaagdieren, die accumulatie van torque voorkomt op de patch kabel mogelijk. Te veel koppel kan koorden draaien leiden tot breuk, en interfereren met de natuurlijke beweging van het dier tijdens het testen. Bevestig het dier patchkabel aan de collector. Bevestig een verbinding gespleten huls aan de vrije metalen ferrule uiteinde van het dier patch kabel (figuur 5). Forceer de mouw helemaal tot het beentje; laat ~ 0.5 cm huls blootgesteld is wat verbinding met de geïmplanteerde glasvezel aangebracht op het dier (figuur 6). Kritische stap: Altijd aankoop mouwen die een split bevatten om uitbreiding van huls over geïmplanteerde vezels beentje mogelijk te maken tijdens verbinding enverwijdering. Te strak van een fit kan ernstig trauma veroorzaken aan het dier als het implantaat loskomt van de schedel bij een poging om de hoes van het implantaat los te koppelen. Als dit toch gebeurt, moet het dier uit de studie worden verwijderd en onmiddellijk de dierenarts zorg. Ook voor het gebruik van een nieuwe hoes voor de eerste keer, 'breken in' door het aansluiten en loskoppelen van een ferrule totdat hij verbreekt met de gewenste hoeveelheid kracht. Tip: Het is gemakkelijk om een vezel te breken tijdens het verwijderen van een huls die nauw verbonden is aan een ferrule. Om dit te voorkomen, duw het beentje door het invoegen van een kleine houten staaf in het open uiteinde van de bus (het handvat van een standaard wattenstaafje is de juiste maat). Sluit de blauwe laser bestuurder om een ​​pulsgenerator met een BNC-kabel en zet de pulsgenerator op. Passende veiligheidsbril op. Stel de schakelaars op de achterzijde van de laser "Curr" en "TTL +" -modus. Zorg ervoor dat that de kracht knop op de voorkant van de bestuurder is ingesteld op nul andturn de laser op (zet de bestuurder op de eerste en vervolgens de laser-toets). Pas de macht knop op de voorzijde van de laser zodat 5-10 mW wordt uitgezonden door het dier flardkoord vezelpunt als gemeten met een lichtvermogen meter. 5-10 mW is een algemene richtlijn – precies vermogensintensiteit moeten beïnvloeden een gegeven volume weefsel moeten vóór de start van het experiment wordt berekend, zoals in Aravanis et al 3. Schakel de blauwe laser op "Analoog" modus voor in vivo stimulatie. Opmerking: Geel DPSS lasers worden gebruikt in TTL + modus voor een constante verlichting. Wacht 10-15 minuten voor de laser op te warmen. Zachtjes bedwingen van de muis en sluit de split-hoes op het dier patchkabel om de chronische implanteerbare vezel (zie figuur 6). Zorg ervoor dat de uiteinden van de beide vezels maken fysiek contact met elkaar. Gebruik de splitsing op de mouw aansluiting als eenvenster om direct contact tussen de twee visualiseren Kritische stap:. Soms vuil kan verzamelen over de metalen ferrule van implanteerbare vezels van het dier en interfereren met de juiste aansluiting. In dit geval gebruikt u een ethanol doekje om voorzichtig te reinigen het beentje op de kop van het dier voorafgaand aan de bevestiging. Probeer nooit een verbindingsmof via ferrule dit ernstig trauma veroorzaken aan het dier. Als een fysieke verbinding tussen vezeluiteinden niet gemaakt kan worden na het reinigen, verwijder het dier uit de studie. Tip: Lichte lekkage kan optreden op het verbindingspunt tussen de geïmplanteerde vezel en dier patchkabel. Visualisatie van dit licht door knaagdieren kan een experimentele verwarren 10 presenteren. Krimpkous kan worden bevestigd aan patchkabels en gleed over het aansluitpunt om vreemd licht te minimaliseren. Laat de muis te herstellen gedurende enkele minuten vóór de aanvang van gedragstesten. Tip: Dfhankelijk de gedragstest te dienen, is het het beste om muizen voor de verbinding en tethering proces wennen 2 – 3 dagen, als de behandeling nodig is om het dier te verbinden stress kan induceren en verwarren gedragstesten. Plaats de muis in de gedragswetenschappen testapparatuur ervoor te zorgen dat de stekker uit het stopcontact is vrij van haken en ogen. Laat nooit een dier zonder toezicht tijdens de stimulatie. Zelfs met het gebruik van commutatoren, hoeft patch koorden hebben de neiging te verdraaien gedurende langere tijdsperioden en kan interfereren met gedragstesten. Gebruik een pulsgenerator de blauwe laser puls met een vooraf bepaalde frequentie die opsin keuze activeert. Voor geel laser gebruik: pulseren de gele laser met externe shutters of door simpelweg blokkeren van de bundel pad met een ondoorzichtige, niet-reflecterend, niet brandbaar object. 4. bericht In vivo stimulatie Overwegingen Dit gedeelte is niet bedoeld om een ​​complete proto zijncol, maar wordt aangeboden als leidraad voor de aanvullende procedures die moeten worden overwogen na in vivo optogenetische stimulatie. Na voltooiing van een experiment, bevestigen virale en fibre placement histologisch voor een nauwkeurige interpretatie van gedragsmatige resultaten. Euthanaseren dier volgens de institutionele richtlijnen en perfuseren het dier met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS. Verwijder geïmplanteerde glasvezel door stevig vast te grijpen de blootgestelde metalen ferrule met een tang of hemostats. Trek in een vloeiende, maar toch snel, beweging. Het is belangrijk dat de integriteit van de geïmplanteerde vezel getest door meting van de lichtopbrengst aan het einde van elk experiment. Post-fix de hersenen in paraformaldehyde gedurende ten minste 24 – 48 uur vóór het snijden door het gebied van belang. (Bij gebruik van een bevriezing microtoom, incubeer hersenen in een 30% sucrose oplossing voor enkele dagen voor het snijden). Uit te voeren met behulp van immunohistochemie standard protocollen voor de detectie van de geschikte-opsin tagged fluoroforen, dat wil zeggen, groen fluorescent eiwit (GFP), verbeterde gele fluorescerende eiwit (eYFP) of mCherry. Controleer plaats van opsin meningsuiting en vezels implantaat onder een microscoop en visueel bevestigen juiste plaatsing van het virus injectie en implantaat op basis van gekozen coördinaten.