In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

! ACHTUNG: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Laser der Klasse 3b und der richtigen Ausbildung und Sicherheitsrichtlinien erfordern, zu beachten. Schutzbrille muss jederzeit im Betrieb Laser getragen werden, mit Assoziierung Verfahren stellt ein besonders hohes Risiko. Kontaktieren Sie den Laser-Anbieter, um die Brillen, die maximale Dämpfung für einen bestimmten Laser bieten wird zu bestimmen. Falls verfügbar, einschreiben in einem institutionellen Laserschutz-Schulung. Nie einen Laser zu betreiben, ohne die entsprechende Schutzbrillen und Ausbildung. 1. Laser Apparat Set-up Gegebenenfalls werden die Schritte in Abschnitt 1 (A) oder (B) bezeichnet, um zwischen einem oder zwei Lasersystemen zu unterscheiden sind. Befestigen und sichern Sie Laser mit dem Steckbrett. Breadboards sind hervorragende Wärmeleiter und fungieren als Kühlkörper, um Schäden an internen Laserkomponenten bei längerem Gebrauch zu verhindern. (A) Befestigen Sie den Pre-gekoppelten laser auf eine 10 "x 12" Steckbrett (oder nach Bedarf) mit ¼-20 "Kopfschrauben und Unterlegscheiben (Abbildung 2A). Wenn Steckbrett Löcher nicht mit Laser-Befestigungslöcher auszurichten, verwenden Sie kleine "Tischklemmen" zu sichern, um Lasersteckbrett. (B) Wenn die 2-Laser verwendet werden sehr unterschiedliche Strahlhöhen (> ~ 1 cm), verwenden Sie kleine 4 "x 6" Breadboards, eine Plattform für einen der Laser zu schaffen. Bringen Sie diese Boards zu den wichtigsten großen 12 "x 18" Steckbrett mit ¼-20 "Zylinderschrauben mit Unterlegscheiben, dann bringen Sie den Laser auf den kleineren Platten mit Schrauben oder Tischklemmen wie in 2B gezeigt. Schließen Sie das andere Laser direkt auf das Steckbrett mit Schrauben oder eine variable Höhe Tischklemme. Critical Schritt: Breadboards, Schrauben und optischen Komponenten können als metrische oder das Zoll erworben werden so konsequent sein beim Kauf von Artikeln; der Standard für dieses Protokoll ist Kaiser. (A)Bringen Sie einen dicken Mantelflach spalten / Körperkontakt (FC / PC) Patchkabel an den Koppler (als Koppler Kabel bezeichnet; siehe Abbildung 3), die physisch mit dem vor dem Laser (2A) verbunden ist. (B) Führen Sie den Koppler auf eine ¾ "optischen Post, dann Epoxid die Verbindung zwischen dem Koppler und der Spitze der Post mit JB Kwik oder ähnliche Epoxy, Lösen und Fehlausrichtung während der Verwendung zu verhindern. Befestigen Sie den Pfosten mit dem Steckbrett (wie die Steckbrett Bohrungen decken sich nicht immer eine Linie mit der gewünschten Anordnung von optischen Komponenten, ein Posthalter, Standfuß Adapter und Klemmgabel verwendet werden, um des Kopplers optisch Beitrag zu befestigen). Bringen Sie einen dicken Mantelpatchkabel (Koppler Kabel) an der Rückseite des Kopplers. (B) Legen Sie die erste Lenkspiegel für den blauen Laser in die kinematische Halterung und befestigen Sie es mit dem Steckbrett mit einem ¾ "optischen Post. Fügen Sie diesen Beitrag zu einer Basis adapter und Spanngabel. Positionieren Sie die Spanngabel und veröffentlichen Montage direkt vor dem blauen Laser mit Spiegel um 45 ° gedreht, um den Laser auf die dichroitischen Spiegel lenken. Verwenden Sie das Raster der Bohrungen auf dem Steckbrett als grobe Ausrichtungsführung. Sobald grob positioniert, mit einem ¼ "-20 Schraube, um die Spanngabel mit dem Steckbrett zu sichern (siehe Abbildung 2B, C). (B) Legen Sie die dichroitischen Spiegel in eine kinematische Halterung und befestigen es an einem 1 "optischen Post und direkt zu sichern, um dem Steckbrett. Positionieren Sie den dichroitischen Spiegel auf die weit von links, und in Übereinstimmung mit, blauen Laserspiegel. Winkel der dichroitische Spiegel in einem Winkel von 45 °, so dass blaues Licht reflektiert den ersten Spiegel in den Koppler reflektiert, dann ziehen Sie die Schraube Befestigung des kinematischen Halterung an der Säule (siehe Abbildung 2B, C). (B) Befestigen Sie den ersten Umlenkspiegel für die gelbe Laser zu einem ¾ "optischen Post. Befestigen Sie die optical Beitrag zu einem Basisteil und Spanngabel. Positionieren Sie die Spanngabel und Post-Ensemble direkt vor dem gelben Laser und Winkel der Spiegel in einem Winkel von 45 °, so dass gelbes Licht wird in Richtung des zweiten Steuerspiegel gerichtet werden. Sichern Sie die Spanngabel in Ort mit einem ¼ "-20 Kopfschraube und Unterlegscheibe. (B) Befestigen Sie den zweiten Steuerspiegel für die gelbe Laser zu einem 1 "optischen Post. Winkel der Spiegel, so daß die gelbe Lichtstrahl von dem ersten Spiegel wird durch den dichroitischen und in den Koppler (2C) reflektiert werden. Sichern Sie die Post direkt an die Steckbrett und ziehen Sie die Befestigungsschraube, wenn der Spiegel ist abgewinkelt angemessen. Feine Spiegel Anpassungen werden über die kinematische Spiegelhalter in einem späteren Schritt durchgeführt werden. (B) Schließen Sie einen Neutraldichtefilter Rad zu einem ¾ "optischen Post und legen Sie die Post in eine Stelleninhaber zu einer Montageplatte befestigt. Sichern Sie das Ensemble mit dem Steckbrett zwischen dem ersten und second gelbe Spiegel mit einem einzigen ¼ "-20 Schraube. Dieses Rad wird verwendet, um die Kraft der gelben Laserlicht erreicht den Koppler anzupassen. Tipp: Alle Komponenten (wie die Schrauben, mit denen kinematische Spiegelhalter an die Spitze der Beiträge und den Fäden hält Basisadapter auf den Boden der Beiträge), bevor Sie sie an die Basis individuell fest. Verwenden Sie eine Welle eines kleinen Sechskantschlüssel in den Durchgangslöchern in der optischen Kommentare über genügend Drehmoment zu erhalten. Dadurch wird verhindert, Komponenten Lösen während des Gebrauchs, erfordern Neuausrichtung. Befestigen Sie eine FC / PC zu FC / PC L-Winkel-Adapter mit dem Steckbrett. Optional: Sichern Sie sich einen 1 x 2 50/50 Miniwürfel Faserteiler direkt auf dem Steckbrett für die gleichzeitige in vivo Stimulation von zwei oder mehr Tiere. Zusätzlich können Griffe zugegeben werden, um eine Bewegung der Lochrasteranordnung zu unterstützen (wie in 2A zu sehen ist). 2. Laser-Kopplung (Berührungslos-Klauenkupplung-) Dieser Abschnitt bezieht sich auf die Dual-Laser-Set-up (2B). Richten Sie die innere blaue Laser-Pfad vor dem Ausrichten die äußere gelbe Laserpfad. ! ACHTUNG: Verwenden Sie eine niedrige Lichtleistung Kopplung (~ 1 mW) auf Augensicherheit zu gewährleisten. Schutzbrille tragen, um das Gerät dem Laser und bis Lichtintensität gemessen und als sicher zu sein. Stellen Sie die Schalter auf der Rückseite des Lasers auf "Curr" (Strom) und Transistor-Transistor-Logik-Modus (TTL) + für konstante Beleuchtung (im Gegensatz zu Analog-Modus). Stellen Sie sicher, dass die Stromknopf auf der Vorderseite des Fahrers wird auf Null gesetzt. Einschalten des Lasers durch Einschalten des Treibers und dann die Lasertaste. Langsam stellen Sie den Stromknopf auf der Vorderseite des Lasertreiber, so dass ~ 1 mW Laserlicht emittiert wird entfernt. Warten Sie 10 bis 15 Minuten (oder laut Herstellerangaben) für die Laser, um sich aufzuwärmen. Schließen Sie das Glasfaserkabel Tester direkt an den free Ende der Kupplung Patchkabel und schalten Sie den Kabeltester (3A). Stellen Sie den Winkel des Kopplers, so daß der rote Strahl geradeaus fährt zurück in Richtung der Mitte des dichroitischen Spiegels. Der Strahlengang des roten Lichtes von der Kabeltester emittiert ist der genaue Weg, der die ankommende Laserlicht benötigen, um zu folgen, um in den Laser gekoppelt werden. Führen Sie eine Grobausrichtung: Verwenden Sie die seitlichen und horizontalen Knöpfe an den kinematischen Spiegel, um den Strahl von Laserlicht in die Kupplung zu steuern. Die Sockelklemmen müssen möglicherweise gelockert, um etwas neu zu positionieren, die Spiegel und die Kupplung werden. Die kinematischen Halterungen sollten noch einige Reisen für weitere Feineinstellungen zur Verfügung. Seien Sie nicht beunruhigt, wenn kein blaues Licht wird von den Koppler angeschlossenen Patchkabel zu diesem Zeitpunkt ausgegeben. Platzieren einer einzigen Stück halbdurchlässiges Papier unmittelbar vor dem dichroitischen Spiegel, zwischen dem dichroitischen Koppler und. Es wird sowohl eine blaue und ared Punkt auf diesem Papier aus dem Laser und dem Kabeltester auf. Verwenden Sie Papier, das lichtdurchlässig ist genug, um sowohl die roten und blauen Flecken gleichzeitig über dieselbe Seite des Papiers zu sehen. Feineinstellungen für die erste Lenkspiegel (dh diejenige, die näher zu dem Laser, nicht der dichroitischen) durch vorsichtiges Einstellen der seitlichen und horizontalen Reglern die Mitte des roten Punktes mit den blauen Punkt auszurichten. Bewegen des Papiers zurück in Richtung des Kopplers, so dass es direkt vor dem Koppler und die Regler auf der zweiten (dh dichroitischen) Spiegel, um den Laserstrahl mit dem roten Strahl auszurichten. Durchlaufen Sie die Schritte 2.6 und 2.7, bis die Mitte der blau / gelben und roten Strahlen werden genau in beiden Positionen ausgerichtet (dh bis die roten und blauen Strahlen kollinear sind). Entfernen Sie die Kabeltester vom Koppler Kabel. Laserlicht sollte jetzt vom Ende der Kupplung Patchkabel emittiert werden. Bestimne Kopplungseffizienz durch die Messung der Lichtenergie von der Faserspitze der Kupplerpatchkabel mit einem Leistungsmesser emittiert. Verwenden Sie die 500 mW Einstellung auf Fotodiode des Power Meters und ändern Sie die Einstellung der Wellenlänge (λ) bis blau (473 nm) oder gelb (635 nm) Spektrumlicht in Abhängigkeit von der verwendeten Lasers. Legen Sie die Faserspitze senkrecht zur Photodiode, eine Strommesswert zu erhalten. Vergleichen der Lichtleistung in die Koppler mit der Lichtleistung von dem Faserende ausgestrahlt wird. Eine Kopplungseffizienz von> 80% wird als sehr gut. Sehr kleine weitere Anpassungen des zweiten Steuerspiegel kann manchmal etwas verbessern Kupplung. Im allgemeinen, wenn das Strahlenmuster von dem Ende des Kopplungsfaser ist eine kleine, enge, zentrale Stelle (ohne Ringe umgibt), die Kopplungseffizienz in den Faserkern ist optimal. Wiederholen Sie die Schritte 2,1 bis 2,11 für Gelb Lasereinkopplung, außer mit den beiden Lenkspiegeln für die gelbe Laser (siehe 2C). Do not Stellen Sie die Position des dichroitischen Spiegels oder Ausrichtung des blauen Lasers verloren. 3. In vivo optogenetische Stimulation Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren, die Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den örtlichen und nationalen Richtlinien, die von der entsprechenden Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt und genehmigt. Optikfaseraufbau (siehe 3B zur Identifizierung der verschiedenen Arten von Patchkabeln im Folgenden). Zur Stimulierung einer einzelnen Maus, den Steckverbinder Patchkabel zu einer dicken Mantelpatchkabel mit dem FC / FC L-Winkel-Adapter direkt mit dem Steckbrett befestigt ist (siehe 4A). Um zwei Tiere von einem Laser anregen, den Steckverbinder Patchkabel an zwei dicken Mantelpatchkabel mit dem 1 x 2 50/50 Mini-Cube (siehe 4B). Um drei oder mehr Tiere zu stimulieren, schließen Sie das Kupplungskabel an eine Multimode-Faser-Splitter mit dem 1 x 2 mini-Cube bereits mit dem Steckbrett befestigt (siehe 4C). Schließen Sie einen Umschalter / Drehgelenk mit den freien Enden der dicken Mantelpatchkabel / Faser-Splitter. Kommutatoren sind wichtig, da sie die Drehung der Faser mit der Nager Bewegung, die Anhäufung von Drehmoment auf die Patchkabel verhindert ermöglichen. Zu viel Drehmoment Kordeln drehen, führen zu Bruch, und stören die natürliche Bewegung des Tieres während des Tests. Befestigen Sie das Tier-Patchkabel an den Kommutator. Befestigen Sie eine Verbindungsspalthülse auf die freie Metallring Ende der Tierpatchkabel (Abbildung 5). Sie die Hülse nicht mit Gewalt den ganzen Weg bis die Hülse; verlassen ~ 0,5 cm der Hülse ausgesetzt als das ist, was eine Verbindung mit dem implantierten Glasfaser dem Tier befestigt (Figur 6). Critical Schritt: Immer Kauf Ärmel, die eine Spaltung enthalten, um Expansion der Hülse über implantiert Faserferrule während der Verbindung zu ermöglichen undEntfernung. Zu eng der Passung kann schwerem Trauma für das Tier führen, wenn sich das Implantat ablöst vom Schädel beim Versuch, die Hülse von dem Implantat zu trennen. Wenn dies auftritt, sollte das Tier aus der Studie entfernt werden und Sie erhalten sofortigen Tierarzt Pflege. In ähnlicher Weise, bevor Sie eine neue Hülse zum ersten Mal, "brechen sie in 'durch Einstecken und Entfernen einer Hülse, bis sie mit der gewünschten Menge an Kraft trennt. Hinweis: Es ist einfach, einen Faserbruch beim Entfernen einer Hülse, die fest an einer Hülse befestigt ist. Um dies zu vermeiden, drücken Sie die Hülse aus, indem Sie einen kleinen Holzstab in das offene Ende der Hülse (der Griff eines Standard Wattestäbchen ist die richtige Größe). Verbinden Sie den blauen Laser-Treiber an einen Impulsgenerator mit einem BNC-Kabel und schalten Sie das Aggregat auf. Setzen Sie geeignete Schutzbrille auf. Die Schalter auf der Rückseite des Lasers und "TTL +" mode "Curr". Stellen Sie sicher, that die Stromknopf auf der vor dem Fahrer auf Null gesetzt andturn der Laser (drehen Sie den Fahrer auf den ersten und dann den Laser-Taste). Stellen Sie den Stromknopf auf der Vorderseite des Lasers, so dass 5 bis 10 mW ist gegen Tierpatchkabel Faserspitze emittiert wie unter Verwendung eines Lichtleistungsmesser. 5-10 mW ist eine allgemeine Richtlinie – die genaue Stromstärke erforderlich ist, um Auswirkungen auf ein gegebenes Gewebevolumen sollte vor Beginn des Experiments berechnet werden, wie in Aravanis et al 3. Schalten Sie den blauen Laser in den Modus "Analog" für die in vivo-Stimulation. Hinweis: Yellow DPSS-Laser werden in TTL + Modus für konstante Beleuchtung betrieben. Warten Sie 10-15 Minuten für die der Laser, um sich aufzuwärmen. Zurückhalten vorsichtig die Maus und schließen Sie das Split-Hülse auf dem Tierpatchkabel mit dem chronischen implantierbaren Faser (siehe Abbildung 6). Sicherstellen, dass die Enden beider Fasern physischen Kontakt miteinander stehen. Verwenden Sie den Split auf der Verbindungshülse alsFenster, um den direkten Kontakt zwischen den beiden Visualisierung kritischer Schritt. Manchmal Ablagerungen können auf dem Metallring von implantierbaren Faser des Tieres sammeln und stören die richtige Verbindung. In diesem Fall verwenden Sie ein Ethanol abwischen, um sanft reinigen Sie die Hülse auf den Kopf des Tieres vor der Anbringung. Niemals eine Verbindungsmuffe Kraft über die Hülse, da dies zu schweren Verletzungen des Tieres führen. Wenn eine physikalische Verbindung zwischen Faserenden können nach der Reinigung nicht gemacht werden, entfernen Sie das Tier aus der Studie. Tipp: Leichte Leckage an der Verbindungsstelle zwischen dem implantierten Fasern und Tierpatchkabel erfolgen. Visualisierung von diesem Licht durch Nagetiere können eine experimentelle verwechseln 10 zu präsentieren. Schrumpfschlauch kann an Patchkabel angebracht werden und glitt über den Verbindungspunkt von Fremdlicht zu minimieren. Lassen Sie die Maus, um ein paar Minuten vor dem Beginn der Verhaltenstests zu gewinnen. Tipp: D* je nach Verhaltenstest verabreicht werden soll, ist es am besten, um Mäuse zu der Verbindungs- und Anbindungsprozess 2 habituate – 3 Tage vor, da die Handhabung erforderlich ist, um das Tier anschließen kann Stress induzieren und verwechseln Verhaltenstests. Platzieren Sie die Maus in der Verhaltens-Testgerät sicherstellen, dass die Verbindungsschnur ist frei von Baumstümpfen. Lassen Sie niemals ein Tier unbeaufsichtigt während der Stimulation. Auch bei der Verwendung von Kollektoren, Patchkabel haben eine Tendenz, während der längere Zeit drehen und kann mit Verhaltenstests stören. Verwenden Sie einen Impulsgenerator, um die blauen Laser mit einer bestimmten Frequenz, die Opsin der Wahl aktivieren pulsiert. Für gelbe Laser Verwendung: Puls der gelben Laser mit Außenjalousien oder einfach durch die Blockierung der Strahlengang mit einem undurchsichtigen, nicht reflektierenden, nicht brennbar Objekt. 4. Beitrag In vivo Stimulation Überlegungen Dieser Abschnitt ist nicht beabsichtigt, eine vollständige proto seincol, sondern als Leitlinien für weitere Verfahren, die folgenden in vivo optogenetische Stimulation berücksichtigt werden sollten, angeboten. Nach Beendigung des Experiments bestätigen viralen und Faserauflegekopf histologisch auf genaue Interpretation der Verhaltensergebnisse. Euthanize Tier gemäß gültiger Richtlinien und durchströmen das Tier mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 4% (w / v) Paraformaldehyd in PBS. Entfernen implantierten Lichtwellen durch festes Ergreifen der freiliegenden Metallring mit einer Zange oder Hämostatika. Ziehen Sie in einer gleichmäßigen, aber schnell, Bewegung. Es ist wichtig, die Integrität der implantierten Faser durch Messen der Lichtleistung am Ende jedes Experiments getestet. Post-fix die Gehirne in Para für mindestens 24 bis 48 Stunden vor dem Schneiden durch die interessierende Region. (Bei Verwendung eines Gefriermikrotoms, Inkubation Gehirne in einer 30% Saccharoselösung für mehrere Tage vor dem Schneiden). Führen Immunhistochemie mit standard Protokolle zum Nachweis der entsprechenden Opsin-tagged Fluorophore, also grün fluoreszierende Protein (GFP), gelb fluoreszierendem Protein verbessert (eYFP) oder mCherry. Überprüfen Website von Opsin Ausdruck und Faser Implantat unter dem Mikroskop visuell geeignete Platzierung der Virusinjektion und Implantat auf Basis von ausgewählten Koordinaten bestätigen.