齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

！注意：このプロトコルは、クラス3Bレーザーの使用を伴い、従うべき適切な訓練や安全ガイドラインが必要になります。レーザーを操作する場合、安全ゴーグル、アライメントの手順は特に高リスクを提示すると、常に着用しなければならない。所定のレーザのための最大限の減衰を提供しますアイウェアを決定するために、レーザープロバイダにお問い合わせください。利用可能な場合は、制度的レーザー安全トレーニングコースに入学。適切な安全眼鏡やトレーニングなしでレーザーを使用しないでください。 1.レーザ装置セットアップ適切な場合には、第1のステップは、それぞれ、シングルまたはデュアルレーザシステムを区別するために（A）または（B）として指定される。 ブレッドボードにレーザーを取り付け、固定します。ブレッドボードは、優れた熱伝導体であり、長期間の使用による内部レーザ部品の損傷を防止するためのヒートシンクとして働く。 （A）は事前に結合されたラスセキュアER¼-20「キャップネジとワッシャー（ 図2A）を使用して、10 "×12"ブレッドボード（または必要に応じて）へ。ブレッドボードの穴がレーザーの取り付け穴に合わせていない場合は、ブレッドボード、レーザーを確保するために小さな 'テーブルクランプを'を使用します。 2レーザが使用される場合（B）は、非常に異なるビームの高さ（>約1 cm）を持つレーザーのいずれかのプラットフォームを作成するために小4 "×6"ブレッドボードを使用する。 図2Bに示すように、キャップネジまたはテーブルクランプを使用してより小さなボードにレーザーを取り付けた後、「ワッシャー付きキャップネジを1/4 20を使用して、メイン大12 "×18"ブレッドボードにこれらのボードを取り付けます。キャップネジまたは可変の高さテーブルクランプを使用してブレッドボードに直接他のレーザを取り付けます。 重要なステップ：ブレッドボード、ネジ、および光学部品は、アイテムを購入するときに一貫性が皇室またはメトリックとして購入することができます。このプロトコルのデフォルトは帝国です。 （A）物理的にレーザー（ 図2A）の前面に装着され、カプラ（ 図3参照カプラーコードとも呼ばれる）への厚いジャケットフラットクリーブ/物理的な接触（FC / PC）パッチコードを添付します。 （B）は、使用中に緩みやずれを防ぐために、カプラーとJB Kwikの、または類似のエポキシを使用して、ポストの上部との間の接合部をエポキシ、¾ "光ポスト上にカプラを通します。 （ブレッドボードの穴が常に光学部品の必要な配置と整列、ポストホルダー、台座ベースアダプタ、およびフォークをクランプしないような場所で、カプラの光ポストを固定するために使用されます）ブレッドボードにポストを取り付けます。カプラーの背面に厚いジャケット付きパッチコード（カプラーコード）を取り付けます。 （B） キネマティックホルダーに青色レーザーの最初のステアリングミラーを挿入し、¾ "光ポストを使用してブレッドボードに取り付けます。ベースADAPにこのポストを取り付けますタークランプフォーク。クランプフォークを置き、ダイクロイックミラーに向けてレーザーを操縦する45°の角度を鏡で青色レーザーの正面にアセンブリを投稿してください。ラフアライメントガイドとしてブレッドボードの穴のグリッドパターンを使用してください。一度、大きく配置し、（、Cを図2Bを参照）ブレッドボードにクランプフォークを固定するために¼ "-20キャップねじを使用。 （B） キネマティックホルダーにダイクロイックミラーを挿入し、1「光ポストに添付してブレッドボードに直接固定します。遠くの左側に、ダイクロイックミラーを配置し、青色レーザミラーに沿っ。角度は、青色光は第1ミラーで反射されるように45°の角度でダイクロイックミラーは、（ 図2B、C参照 ）ポストにキネマホルダーを取り付けるネジを締めた後、カプラに反映されます。 （B）は、¾ "光ポストに黄色のレーザーのための最初のステアリングミラーを取り付けます。 OPTIを取り付けベースアダプタとクランプフォークへのCALポスト。黄色の光が第2のステアリングミラーに向けられるような45°の角度で位置黄色レーザーの前面と角度を直接クランプフォークとポストアンサンブルミラー。 ¼ "-20キャップネジとワッシャーで所定の位置にクランプフォークを固定します。 （B）1「光ポストに黄色レーザに第2ステアリングミラーを取り付けます。角度第1ミラーからの黄色光はダイクロイックカプラ（ 図2C）に反映されるようにミラー。ブレッドボードに直接ポストを固定し、ミラーが適切に角度付けしたら取り付けネジを締めます。微鏡の調整は、後の工程でキネマティックミラーマウントを用いて説明する。 （B）¾ "光ポストに減光フィルタホイールを取り付け、取り付けベースに取り付けポストホルダーにポストを置く。最初とSEの間でブレッドボードにアンサンブルを固定しますシングル¼ "-20キャップネジを使用してCOND黄色のミラー。このホイールは、カプラに到達する黄色レーザ光のパワーを調整するために使用される。 ヒント：個別ベースにそれらを取り付ける前に（そのような記事のトップにキネマティックミラーホルダーを固定しているネジ、ポストの底にベースアダプタを保持するスレッドなど）すべてのコンポーネントを締めます。十分なトルクを得るために、光のポストに設けられた貫通穴に小さな六角レンチのシャフトを使用してください。これにより、コンポーネントは再編が必要、使用中に緩んで来て防ぐことができます。 ブレッドボードにFC / PC L型ブラケットアダプタにFC / PCを接続します。 オプション：2つ以上の動物の同時in vivoでの刺激のためのブレッドボードに直接1×2 50/50ミニキューブファイバースプリッタを固定します。さらに、ハンドルは（ 図2Aに見られるように）ブレッドボードアセンブリの移動を補助するために添加することができる。 2.レーザーカップリング（非接触スタイルカップ） このセクションでは、デュアルレーザーセットアップ（ 図2B）にも関する。外側の黄色のレーザー経路を位置合わせする前に、内側の青色レーザーパスを合わせます。 ！注意：目の安全を確保するために、低光電力結合（〜1 MW）を使用してください。レーザーおよび光強度を測定し、安全であるとみなされるまで電源への安全ゴーグルを着用する。 レーザーの背面にスイッチを設定する「CURR」（電流）と、トランジスタ – トランジスタ論理モード（TTL）+一定の照明用​​（アナログモードではなく）。ドライバの前面にある電源ノブをゼロに設定されていることを確認してください。最初にして、ドライバにレーザーキーを回して、レーザーをオンにします。 〜1mWのレーザー光が放射されるように、ゆっくりとレーザドライバの前面にある電源ノブを調整します。 15分（またはメーカーが指定されている）、レーザーのウォームアップするために – 10を待ちます。 がfreに直接光ファイバケーブルテスターを接続するEカプラーパッチコードの端とケーブルテスター（ 図3A）をオンにします。赤い光はバックストレートダイクロイックミラーの中心に向かって走行するようにカプラの角度を調整します。ケーブルテスターから出射される赤色光のビーム経路は、入射レーザ光は、レーザに結合させるために実行する必要があります正確なパスである。 粗アライメントを実行してください。カプラーにレーザ光のビームを操縦する運動学的鏡に横方向と水平方向のノブを使用してください。ペデスタルクランプは少し鏡とカプラーを再配置する緩めることが必要になる場合があります。キネマティックマウントはさらに、微調整のために利用可能ないくつかの旅行を持っている必要があります。何青色光は、この時点でカプラー付パッチコードの外に放出されないされても心配する必要はありません。 ダイクロイックとカプラの間に、 直接、ダイクロイックミラーの前で半透明の紙一枚を置きます。青と​​ARの両方があるでしょうEDはそれぞれ、レーザーおよびケーブルテスタからこの紙の上に点在しています。紙の同じ側から同時に赤と青の斑点の両方を見ることが十分に半透明である紙を使用してください。 最初のステアリングミラーを微調整する（ すなわち、レーザーではなく、ダイクロイックに近い方）を慎重に青いドットと赤のドットの中心を位置合わせするために、横方向と水平方向のノブを調整することによって。 それはカプラーの正面になるように、バックカプラに向かって紙を移動し、赤色光のレーザービームを整列させるために第二 （ すなわち、ダイクロイック）ミラー上のノブを調整します。 （赤と青のビームが同一直線上になるまで、すなわち ）/青黄色と赤のビームの中心が正確に両方の位置に整列されるまで、2.6＆2.7を繰り返し反復処理。 カプラーコードからケーブルテスターを外します。レーザ光は今やカプラパッチコードの端から出射されるべきである。 Determi電力計を使用してカプラーパッチコードの光ファイバの先端から出射される光パワーを測定することによってね結合効率。パワーメータのフォトダイオード上の500 mWの設定を使用し、使用されている青（473 nm）以下のレーザーによっては黄色（635 nm）のスペクトル光の波長設定（λ）を変更。 電力測定値を得るために、フォトダイオードと垂直なファイバーチップを置きます。ファイバ端から出射された光パワーにカプラーに入る光パワーを比較してください。 > 80パーセントの結合効率が非常に良いと考えられている。第2ステアリングミラーの非常に小さな更なる調整は時々少しカップリングを向上させることができます。結合ファイバの端からのビームパターンは（それを囲むない環を有する）小さな、タイト、中心スポットである場合、一般に、ファイバ·コアに結合効率が最適である。 繰り返しますが、2.1のステップ-黄色のレーザーのための2つのステアリングミラーを使用することを除いて、黄色のレーザーカップリングのための2.11（ 図2Cを参照）。無し飲酒tは、ダイクロイックミラーや青色レーザーの位置合わせの位置が失われます調整します。 3. インビボ光遺伝学的刺激動物の使用を含むすべての手続きは、地域および​​国のガイドラインに沿って実施し、対応する施設内動物管理使用委員会によって承認されていることを確認。 光ファイバーセットアップ（以下に参照パッチ·コードの異なるタイプの識別のために図3Bを参照）。単一のマウスを刺激直接ブレッドボードに接続されたFC / FC L型ブラケットアダプタを使用して厚いジャケット付きパッチコードにカプラーパッチコードを接続するには（ 図4Aを参照）。 1レーザから2匹の動物を刺激するために、1×2 50/50ミニキューブ（ 図4Bを参照）を使用して2つの厚いジャケット付きパッチコードにカプラーパッチコードを接続します。 1×2メートルを使用してマルチモードファイバスプリッタ、カプラコードを取り付ける3つ以上の動物を刺激するINIキューブがすでにブレッドボードに取り付ける（ 図4Cを参照）。 厚手のジャケット付きパッチコード/繊維スプリッタの自由端に整流子/ロータリージョイントを取り付けます。彼らは、パッチコードの上にトルクの蓄積を防ぐ齧歯類の動き、との繊維の回転を可能として、整流子が不可欠である。あまりにも多くのトルクは、コードをねじら破損につながり、およびテスト中に動物の自然な動きを妨げる可能性があります。 整流子に動物のパッチコードを添付します。 動物のパッチコード（ 図5）の遊離金属フェルール端に接続するスプリットスリーブを取り付けます。すべての方法までフェルールをスリーブを強制しないでください。このようにさらさスリーブの0.5センチメートル〜脱退動物（ 図6）に取り付けられた注入された光ファイバに接続するものです。 重要なステップ：常に接続中に移植されたファイバフェルール上のスリーブの拡大を可能にするために、分割が含まれている袖を購入し、除去。インプラントからスリーブを切断しようとしたときに、インプラントが頭蓋骨からdislodges場合、フィット感のきつすぎる動物に深刻な外傷を引き起こす可能性があります。これが発生した場合、動物は試験から除外し、即時の獣医師のケアを受けるべきである。同様に、初めて新しいスリーブを使用する前に、接続し、それは力の目標量と切断するまでフェルールを抜いて」にそれを破る」。 ヒント：それはしっかりとフェルールに装着されたスリーブを除去しながら繊維を破ることは容易である。これを回避するには、スリーブ（標準綿棒のハンドルが正しいサイズである）の開口端に小さな木の棒を挿入してフェルールを押し出す 。 BNCケーブルを使用して、パルス発生器に青色レーザドライバを接続し、上のパルス発生器を回す。 上の適切な安全ゴーグルを置く。レーザーを「CURR」と「TTL +」モードの背面にあるスイッチを設定します。ことを確認してくださいTHAトンドライバの前面にある電源ノブをゼロに設定andturn（最初にしてレーザーキーにドライバをオンにする）にレーザである。 光パワーメータを用いて測定ミリワットが動物パッチコードファイバー先端から放出されている5から10ように、レーザの前面にある電源つまみを調整します。 5から10 mWのは一般的なガイドラインである-組織の特定のボリュームに影響を与えるために必要な正確な電力強度がAravanis らのように、実験開始前に計算されるべきである3。 in vivoでの刺激のために青色レーザーに「アナログ」モードを切り替えます。注：イエローDPSSレーザは、一定の照明のためのTTL +モードで動作する。レーザーがウォームアップするために10〜15分待ちます。 静かにマウスを拘束し、慢性移植可能な繊維への動物のパッチコードに分割スリーブを接続します（ 図6を参照）。両方のファイバの端部が互​​いに物理的に接触していることを確認してください。として接続スリーブでスプリットを使用してください。時々破片が動物の移植可能な繊維の金属フェルールに収集し、適切な接続を妨げる可能性が2つの重要なステップの間の直接接触を視覚化するウィンドウ。この場合には、エタノールを使用し優しく取り付けの前に動物の頭の上にフェルールをきれいに拭く。これは動物に重篤な外傷の原因となりますので、フェルール上の接続スリーブを強制しないでください。ファイバ端部との間の物理的な接続は、洗浄後に行うことができない場合は、研究から動物を削除する。 ヒント：光漏れが注入された繊維や動物のパッチコードとの接続点に発生する可能性があります。げっ歯類によるこの光の可視化は、実験的交絡10を提示することができる。熱収縮チューブは、パッチ·コードに取り付けられ、外光を最小にするための接続点を介してスライドさせることができる。 マウスは行動試験の開始前に数分間に回復することを許可する。 ヒント：D動物を接続するために必要な処理は、ストレスを誘導し、行動試験を混乱可能性がある、3日前まで – 投与すべき行動試験にepending、それは2接続とテザリングプロセスにマウスを慣らすのがベストです。 コネクタコードは思わぬ障害がないことを保証する行動試験装置にマウスを置きます。刺激中の無人の動物を残すことはありません。偶数整流子を用いて、パッチ·コードは、長期間の間にねじれる傾向を有しないし、行動試験を妨害する可能性がある。 選択肢のオプシンを活性化する所定の周波数で青色レーザーをパルスパルス発生器を使用してください。黄色レーザーの使用のために外部シャッターまたは単に不透明、非反射性、非引火性物体を有するビーム経路を遮断することによって、黄色のレーザーパルス。 vivo刺激の考慮事項4.ポストこのセクションは、完全プロトであることを意図されていないCOLしかし、インビボ光遺伝学的刺激後の考慮すべき追加の手順については、ガイダンスとして提供されています。 実験が完了すると、行動の結果の正確な解釈のためのウイルスおよび繊維配置組織学的に確認する。施設のガイドラインに従って、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて動物を灌流し、PBS中の4％（w / v）のパラホルムアルデヒド動物を安楽死させる。 しっかりとペンチや止血に露出した金属フェルールを把握することにより、移植された光ファイバを削除します。 1スムーズ、まだSWIFT、運動に引き上げます。各実験の終了時に光出力を測定することによって注入繊維の完全性をテストすることが重要である。 関心のある領域を通って、切片の前に48時間 – 少なくとも24のためのパラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 （凍結ミクロトームを使用している場合は、切片の数日前に30％ショ糖溶液中で脳をインキュベート）。 standaを用いた免疫組織化学を実行します適切なオプシンタグ付き蛍光体の検出のため番目のプロトコル、すなわち、緑色蛍光タンパク質（GFP）、強化黄色蛍光タンパク質（のeYFP）またはmCherryを。 顕微鏡下オプシンの発現と繊維インプラントのサイトをチェックして、視覚的に選択された座標に基づいて、ウイルス注射とインプラントの適切​​な配置を確認。