Summary

L'uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

Published: March 13, 2014
doi:

Summary

La gravidanza porta a cambiamenti significativi alla composizione in acidi grassi dei tessuti materni. Profili lipidici possono essere ottenuti tramite gascromatografia per consentire l'identificazione e la quantificazione degli acidi grassi nelle singole classi di lipidi tra i ratti alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi durante la gravidanza.

Abstract

Gas cromatografia (GC) è un metodo altamente sensibile utilizzato per identificare e quantificare il contenuto di acidi grassi dei lipidi dai tessuti, cellule e plasma / siero, ottenendo risultati con elevata precisione e alta riproducibilità. Negli studi metabolici e della nutrizione GC permette la valutazione delle variazioni nelle concentrazioni di acidi grassi seguenti interventi o durante cambiamenti di stato fisiologico come la gravidanza. Estrazione in fase solida (SPE) utilizzando amminopropil cartucce di silice permette la separazione delle principali classi di lipidi, tra cui trigliceridi, diversi fosfolipidi e esteri del colesterolo (CE). GC combinato con SPE è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nella composizione in acidi grassi della frazione CE nel fegato dei ratti vergini e gravide che erano stati alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi. Ci sono significativi effetti di interazione di dieta / gravidanza al momento il contenuto di acido omega-3 e omega-6 acidi grassi del fegato CE, che indica che le donne incinte hanno una risposta diversa a manipulat alimentareione che si vede tra le femmine vergini.

Introduction

Gas cromatografia (GC) è una tecnica ben consolidata utilizzato per identificare e quantificare l'incorporazione degli acidi grassi in pool di lipidi e le membrane cellulari 1,2 durante la supplementazione o fisiologiche condizioni come l'obesità (e le malattie correlate come il diabete) o la gravidanza 3 – 5. E 'adatto per analizzare i tipi e le quantità di grassi negli alimenti anche. Questo è utile quando caratterizzare diete sperimentali, nonché di assicurare che l'industria alimentare è conforme alle normative. Ad esempio, GC può essere utilizzata per confermare l'identità e la quantità di acidi grassi di un prodotto come integratore alimentare per garantire che l'etichettatura è corretta e disposizioni sono rispettate 6,7. Analisi di acidi grassi in grado di fornire preziose intuizioni metabolismo dei lipidi nella salute e nella malattia, l'impatto del cambiamento di dieta, e l'effetto delle variazioni di stato fisiologico 8. Uso di GC per studiare campioni durante la gravidanza ha fornito importanteinformazioni sui cambiamenti in acidi grassi e complesso lipidico omeostasi 3.

Prima della separazione cromatografica, lipidi sono generalmente estratti dal campione usando la solubilità dei lipidi in miscele di solventi di cloroformio e metanolo. Viene aggiunto cloruro di sodio per facilitare la separazione della miscela in lipidi acquosa e organica contenente 9,10 fasi. Classi di lipidi complessi di interesse possono essere separati dall'estratto totale di lipidi mediante estrazione in fase solida (SPE). Questa tecnica di separazione eluisce classi di lipidi in base alla loro polarità o di affinità di legame. Triacyglycerols (TAG) ed esteri del colesterolo (CE) vengono eluiti prima come frazione combinata, altre classi, fosfatidilcolina (PC), Fosfatidiletanolamina (PE), e acidi grassi non esterificati (NEFA) sono eluiti aumentando la polarità del solvente di eluizione . La separazione di TAG da CE sfrutta il legame di TAG solo ad una SPE cartri frescodge, permettendo CE da eluito. TAG può essere eluito aumentando la polarità del solvente eluizione 9,10. Questo metodo consente a più campioni da separare simultaneamente con una resa superiore è realizzato con cromatografia su strato sottile, il che significa che i campioni di dimensioni relativamente piccole (per esempio <100 microlitri di plasma o siero, <100 mg di tessuto) possono essere analizzati 11,12.

GC è una tecnica ben consolidata prima descritto nel 1950, è stato suggerito che la fase mobile nei sistemi liquido-liquido poi potrebbe essere sostituito con il vapore. Inizialmente è stato utilizzato per l'analisi del petrolio, ma rapidamente esteso anche ad altri settori quali l'analisi degli aminoacidi e biochimica dei lipidi, che è ancora di grande interesse. Progressi nelle apparecchiature GC e tecnologie come lo sviluppo di colonne capillari dalle colonne impaccate utilizzati in precedenza ha portato alle nostre attuali tecniche in cui gli acidi grassi sono in grado di essereseparati più efficiente a temperature più basse con conseguente GC essendo ordinariamente usato per identificare e quantificare gli acidi grassi in una vasta gamma di indagini 13.

GC richiede acidi grassi per essere derivatizzati in modo che essi possono diventare sufficientemente volatile per essere eluito a temperature ragionevoli senza decomposizione termica. Questo di solito comporta la sostituzione di un gruppo funzionale contenente idrogeno per formare esteri, tioesteri o ammidi per analisi. Esteri metilici vengono comunemente studiate derivati, che sono prodotti da metilazione. In questo metodo i legami estere in lipidi complessi vengono idrolizzati a rilasciare gli acidi grassi liberi, che sono transmethylated a formare esteri metilici degli acidi grassi (FAME). Il profilo risultante di FAME, determinato mediante GC, viene indicato come la composizione in acidi grassi e può essere facilmente confrontata tra diversi gruppi sperimentali 9,10. La tecnica consente entrambe le proporzioni di indiviacidi grassi goli e della loro concentrazione da misurare.

Oltre all'uso di GC per l'analisi di acidi grassi in studi nutrizionali e all'interno del settore alimentare, la tecnica può essere utilizzata in un'ampia gamma di settori analitici. Ad esempio, analisi ambientali mediante GC includono la misurazione della contaminazione delle acque da insetticidi e analisi del suolo misurare il contenuto di clorobenzene. In tossicologia, GC è stato utilizzato anche per identificare le sostanze illegali in campioni di sangue di individui urine e, una tale stimolatori sport 12 e la capacità di separare miscele complesse di idrocarburi rende questa tecnica popolare nell'industria petrolifera per l'analisi petrolchimica 12.

La gravidanza è associata a cambiamenti significativi nella composizione in acidi grassi dei tessuti materni in particolare, nel contenuto di omega-3 (n-3) e omega-6 (n-6) polinsaturi aci grassids (PUFA) 3. In questo studio, abbiamo esemplificare l'uso di GC nella misura di acidi grassi descrivendo il suo uso nell'analisi della composizione in acidi grassi del tessuto epatico prelevato da ratti vergini e gravidanza alimentati diete a basso ed alto contenuto di grassi con differenti fonti di petrolio. Le diete sperimentali forniti qui sono stati un olio a base di dieta a basso contenuto di grassi di soia, una dieta ricca di grassi a base di olio di soia (130,9 g di grassi totali / kg di grasso totale) o una dieta a base di olio di lino alto contenuto di grassi (130.9 g di grassi totali / kg dieta), disponibile per 20 giorni. La composizione in acidi pieno di nutrienti e grassi di queste diete sono state descritte in precedenza 14. Le diete olio di soia sono ricchi di acido linoleico (18:02 n-6) e contengono alcuni acido α-linolenico (18:03 n-3) mentre la dieta olio di lino è ricco di acido α-linolenico. Queste diete ad alto contenuto di grassi rappresentano diverse razioni di linoleico di α-linolenico acidi (razioni di 08:01 e 01:01, rispettivamente). Il metodo per l'isolamento delle singole classi di lipidi e analisi mediante GC siamo noill stabilito e convalidato, ed è stato pubblicato in precedenza 10, ma senza la descrizione tecnica dettagliata trovata qui.

Protocol

1. Procedure di animali Tutti i lavori degli animali deve essere effettuata in conformità con le Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986). Mate ratti Wistar di età compresa tra 10 settimane da allevamento monogama, e confermare la gravidanza dalla comparsa di un tappo vaginale. Registrare questo come il giorno 1 di gestazione, e di iniziare la dieta sperimentale. Per le femmine vergini, ospitare ogni ratto individualmente, e iniziare la dieta sperimentale. Dopo l'alimen…

Representative Results

Il successo di questo metodo dipende seguendo il protocollo preciso e sull'utilizzo di solventi puliti e reagenti per ridurre 'rumore' e contaminazione che può apparire su un cromatogramma. Campioni contaminati sono più difficili da analizzare, abbassando la precisione dell'area sotto i calcoli della curva. Se il protocollo è seguito con successo un cromatogramma con chiare simmetriche, picchi ben definiti e con il minimo rumore di fondo dovrebbe essere ottenuto come illustrato nella Figura 3….

Discussion

Gascromatografia è una tecnica accurata da utilizzare per l'analisi degli acidi grassi, e la sua elevata riproducibilità ritenga tecnica adatta per analisi cliniche. Colonne GC appropriate devono essere utilizzati per consentire l'identificazione di acidi grassi di interesse, con colonne disponibili avere variazioni nella polarità della fase stazionaria, lunghezza della colonna e il diametro interno. L'uso di una colonna capillare di silice fusa in questo metodo di analisi fornisce una buona stabilità te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere il contributo di Meritxell Romeu-Nadal allo studio sui ratti.

Materials

Methanol: Fisher Scientific M/4056/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Chloroform: Fisher Scientific C/4966/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
BHT: Sigma- Aldrich W218405 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous
NaCl Sigma- Aldrich S9888 Anhydrous
Hexane Fisher Scientific H/0406/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Glacial acetic acid Sigma- Aldrich 695084 'CAUTION' Burns – 99.85%
Sulfuric acid Sigma- Aldrich 339741 'CAUTION' Burns – 99.999%
Potassium carbonate Sigma- Aldrich 209619 99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate Sigma- Aldrich 237205 99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10204340 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied
Toluene Fisher Scientific T/2300/15 'CAUTION' Fumes
Diethyl ether Sigma- Aldrich 309966 'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder BOC 44-w 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges Agilent 12102014 Cartridge – Bead mass 100mg
Silica gel SPE cartidges Agilent 14102010 Cartridge – Bead mass 100mg
Molecular seives Sigma- Aldrich 334324 Pellets, AW-300, 1.6mm
Glass pasteur pipettes Fisher Scientific FB50251
Borosilicate glass test tube Fisher Scientific FB59527 Non-screw cap
Screw thread glass test tubes Fisher Scientific FB59555 13mm
Caps for screw thread test tubes Fisher Scientific FB51353 To fit 13mm tube
Solida phase extraction (SPE) tank Agilent VacElut 20 Manifold
Luer stopcocks for SPE tank Agilent 12131005
Vacuum pump Sigma- Aldrich 2656-194GB-1EA
GC vials Kinesis STV 12-03TS Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert
GC vial lids Kinesis SCC09-0.2B Short thread 9mm blue
GC inlet liners SGE Analytical science 092002 Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm
GC septa SGE Analytical science 041856 11mm, MN material
GC column SGE Analytical science 054612 Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm
Gas chromatograph HP 6890 series

References

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Cite This Article
Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. E., Burdge, G. C., Calder, P. C. The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy. J. Vis. Exp. (85), e51445, doi:10.3791/51445 (2014).

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