L'utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l'analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse
Summary
Grossesse conduit à d'importants changements à la composition en acides gras des tissus maternels. profils lipidiques peuvent être obtenus par chromatographie en phase gazeuse pour permettre l'identification et la quantification des acides gras dans les classes de lipides individuels entre les rats nourris avec des régimes différents de graisse haute et basse pendant la grossesse.
Abstract
chromatographie en phase gazeuse (GC) est une méthode très sensible utilisée pour identifier et quantifier la teneur en acides gras des lipides des tissus, de cellules et de plasma / sérum, donnant des résultats avec une grande précision et une reproductibilité élevée. Dans les études métaboliques et nutrition GC permet l'évaluation des changements dans les concentrations d'acides gras suivants interventions ou lors des changements de l'état physiologique comme la grossesse. Extraction en phase solide (SPE) à l'aide aminopropyliques cartouches de silice permet la séparation des principales classes de lipides, y compris les triglycérides, différents phospholipides et esters de cholestérol (CE). GC combinés avec SPE a été utilisé pour analyser les variations de la composition en acides gras de la fraction CE dans le foie des rats gravides vierges et qui avaient été nourris avec des régimes différents de haute et basse en matières grasses. Il ya des effets d'interaction alimentation / grossesse importantes sur la teneur en acides gras oméga-3 et oméga-6 gras de foie CE, indiquant que les femmes enceintes ont une réponse différente à manipula alimentaireion de s'observe chez les femelles vierges.
Introduction
chromatographie en phase gazeuse (GC) est une technique bien établie utilisée pour identifier et quantifier l'incorporation des acides gras dans les piscines de lipides et les membranes cellulaires 1,2 dans des conditions de supplémentation ou physiologiques tels que l'obésité (et maladies apparentées telles que le diabète) ou la grossesse 3 – 5. Il est également adapté pour analyser les types et les quantités de matières grasses dans les aliments. Ceci est utile lors de la caractérisation des régimes expérimentaux, ainsi que veiller à ce que l'industrie alimentaire conforme à la réglementation. Par exemple, GC peut être utilisée pour confirmer l'identité et la quantité des acides gras dans un produit comme un complément alimentaire pour garantir que le marquage est correct et réglementations sont respectées à 6,7. Analyse des acides gras peut fournir des indications précieuses sur le métabolisme des lipides dans la santé et la maladie, l'impact de la modification du régime alimentaire, et l'effet des changements dans l'état physiologique 8. L'utilisation de GC à étudier des échantillons durant la grossesse a fourni importantedes informations sur les changements dans l'acide gras et l'homéostasie lipidique complexe 3.
Avant la séparation chromatographique, les lipides sont généralement extraits de l'échantillon en utilisant la solubilité des lipides dans des mélanges de solvants de chloroforme et de méthanol. Le chlorure de sodium est ajouté pour faciliter la séparation du mélange en lipides aqueuse et organique contenant 9,10 phases. Classes de lipides complexes d'intérêt peuvent être séparées de l'extrait lipidique total d'une extraction en phase solide (SPE). Cette technique de séparation élue classes de lipides en fonction de leur polarité ou affinité de liaison. Triacylglycérols (TAG) et des esters de cholestérol (CE) sont éluées en premier en tant que fraction combinée, d'autres catégories, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), et les acides gras non estérifiés (AGNE) sont éluées en augmentant la polarité du solvant d'élution . La séparation des TAG de CE exploite la liaison de TAG seulement à une SPE cartri fraisdge, permettant CE pour être élue. TAG peut ensuite être éluée en augmentant la polarité du solvant d'élution 9,10. Cette méthode permet à plusieurs échantillons à séparer simultanément avec un rendement plus élevé que ce qui est réalisé par chromatographie sur couche mince, ce qui signifie que la taille des échantillons relativement petits (par exemple <100 ul de plasma ou de sérum, <100 mg de tissus) peuvent être analysées 11,12.
GC est une technique bien établie décrite dans la première des années 1950, il a été suggéré que la phase mobile dans les systèmes ensuite liquide-liquide peut être remplacé par de la vapeur. Il a d'abord été utilisée pour l'analyse de pétrole mais s'est rapidement développée dans d'autres domaines tels que l'analyse des acides aminés et la biochimie des lipides, qui est toujours d'un grand intérêt. Les progrès de l'équipement et de la technologie GC tels que le développement de colonnes capillaires des colonnes garnies utilisés précédemment a conduit à nos techniques actuelles dans laquelle les acides gras sont en mesure d'êtreséparés de manière plus efficace à des températures inférieures résultant en GC est couramment utilisé pour identifier et quantifier les acides gras dans un large éventail d'enquêtes 13.
GC nécessite des acides gras pour être dérivé afin qu'ils puissent devenir suffisamment volatil pour être élue à des températures raisonnables sans décomposition thermique. Cela implique généralement la substitution d'un groupe fonctionnel contenant de l'hydrogène pour former des esters, des thioesters ou amides d'analyse. Les esters méthyliques sont couramment étudiés dérivés, qui sont produites par méthylation. Dans ce procédé, les liaisons ester dans les lipides complexes sont hydrolysés pour libérer les acides gras libres, qui sont transmethylated pour former des esters gras méthyliques d'acide (EMAG). Le profil résultant de FAME, déterminé par CPG, est désigné comme la composition en acides gras et peut être aisément comparé entre les différents groupes expérimentaux 9,10. La technique permet à la fois les proportions des indiLes acides gras UAL et leurs concentrations à mesurer.
En plus de l'utilisation de CG pour la détermination des acides gras dans les études de nutrition et de l'industrie alimentaire, la technique peut être utilisée dans une large gamme de domaines d'analyse. Par exemple, les analyses environnementales par GC comprennent la mesure de la contamination des eaux par les insecticides et les analyses de sol mesurer la teneur en chlorobenzène. En toxicologie, GC a également été utilisé pour identifier les substances illicites dans l'urine et des échantillons de sang de personnes; une telle performance sportive amplificateurs 12 et la capacité à séparer des mélanges complexes d'hydrocarbures rend cette technique populaire dans l'industrie pétrolière pour l'analyse de la pétrochimie 12.
La grossesse est associée à des modifications importantes à la composition en acides gras des tissus maternels, en particulier dans la teneur en acides gras oméga-3 (n-3) et les acides gras oméga-6 (n-6) aci gras polyinsaturéds (AGPI) 3. Dans la présente étude, nous illustrons l'utilisation de GC dans la mesure des acides gras en décrivant leur utilisation dans l'analyse de la composition en acides gras des tissus du foie prélevé sur des rats vierges et enceintes recevant une ration faible et élevée de graisse avec différentes sources de pétrole. Les rations expérimentales fournies ici sont une base d'huile bas régime de soja gras, un régime riche en graisses de soja à base d'huile (130,9 g Lipides totaux / kg de matière grasse totale) ou un régime à base d'huile de lin riche en graisses (130,9 g Lipides totaux / kg régime), prévue à 20 jours. La composition de ces régimes acide gras complet nutritif et ont été décrites précédemment 14. Les régimes alimentaires d'huile de soja sont riches en acide linoléique (18:2 n-6) et contiennent un peu d'acide α-linolénique (18:3 n-3) tandis que l'alimentation de l'huile de lin est riche en acide α-linolénique. Ces régimes riches en gras représentent les différentes rations de linoléiques à α-linolénique (rations de 08h01 et 01h01, respectivement). La méthode d'isolement des classes de lipides individuels et l'analyse par GC est nousll établi et validé, et a été publié antérieurement 10 mais sans la description technique détaillée trouvé ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chromatographie en phase gazeuse est une technique exacte à utiliser pour l'analyse d'acide gras, et sa reproductibilité élevée juge cette technique convient pour les analyses cliniques. Colonnes de CPG appropriées doivent être utilisées pour permettre l'identification d'acides gras d'intérêt, avec des colonnes disponibles présentant des variations de la polarité de la phase stationnaire, la longueur de la colonne et le diamètre intérieur. L'utilisation d'une colonne capillaire e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner la contribution de Meritxell Romeu-Nadal à l'étude chez le rat.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
