Summary

Der Einsatz von Gas-Chromatographie zu Änderungen der Zusammensetzung der Fettsäuren in Rattenlebergewebe während der Schwangerschaft Analysieren

Published: March 13, 2014
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Summary

Schwangerschaft führt zu signifikanten Änderungen der Fettsäurezusammensetzung von mütterlichem Gewebe. Lipid-Profile können über Gaschromatographie erhalten werden, damit die Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren in den einzelnen Lipidklassen unter Ratten während der Schwangerschaft zugeführt verschiedenen Hoch-und fettarme Ernährung.

Abstract

Gaschromatographie (GC) ist ein auf Basis von Geweben, Zellen und Plasma / Serum zu identifizieren und die Fettsäuren der Lipide, wodurch Ergebnisse mit hoher Genauigkeit und hoher Reproduzierbarkeit hochempfindliche Methode. Im Stoffwechsel-und Ernährungsstudien ermöglicht GC Beurteilung von Änderungen der Fettsäure-Konzentrationen nach Eingriffen oder bei Veränderungen in physiologischen Zustand wie Schwangerschaft. Festphasenextraktion (SPE) mit Aminopropyl-Silicakartuschen ermöglicht die Trennung der Hauptlipidklassen, einschließlich Triglyceride, verschiedene Phospholipide, und Cholesterylester (CE). GC in Kombination mit SPE wurde verwendet, um die Änderungen in der Fettsäurezusammensetzung der CE-Fraktion in der Leber von Jungfrau und trächtige Ratten, die verschiedenen Hoch-und fettarme Ernährung zugeführt hatte zu analysieren. Es gibt signifikante Diät / Schwangerschaft Wechselwirkungen auf die Omega-3 und Omega-6-Fettsäuren von Leber CE, das anzeigt, dass schwangere Frauen eine unterschiedliche Reaktion auf Nahrungs MANIPULATIonen, als unter den jungfräulichen Weibchen gesehen.

Introduction

Gaschromatographie (GC) ist eine gut etablierte Technik, die zur Nahrungsergänzung bei oder physiologischen Bedingungen, wie Fettsucht (und verwandten Krankheiten wie Diabetes) oder Schwangerschaft 3 in Lipidpools und Zellmembranen 1,2 Identifizierung und Quantifizierung des Einbaus von Fettsäuren – 5. Es ist auch für die Analyse der Art und Menge der Fette in Lebensmitteln. Dies ist nützlich bei der Charakterisierung von Versuchsdiäten, sowie die Gewährleistung, dass die Lebensmittelindustrie erfüllt die Norm. Zum Beispiel kann GC verwendet werden, um die Identität und Menge der Fettsäuren in einem Produkt, wie ein Nahrungsergänzungsmittel zu bestätigen, um sicherzustellen, dass die Kennzeichnung korrekt und Vorschriften eingehalten 6,7. Analyse der Fettsäuren können wertvolle Einblicke in den Fettstoffwechsel in Gesundheit und Krankheit, die Auswirkungen der Änderung der Ernährungsgewohnheiten und die Auswirkungen von Änderungen in physiologischen Zustand 8 bereitzustellen. Verwendung von GC-Proben während der Schwangerschaft Studie hat wichtige bereitgestelltInformationen über Änderungen in Fettsäure und komplexe Lipidhomöostase 3.

Vor der chromatographischen Trennung, Lipide werden typischerweise aus der Probe unter Verwendung der Löslichkeit der Lipide im Lösungsmittel Mischungen aus Chloroform und Methanol extrahiert. Natriumchlorid wird zugegeben, um die Trennung der Mischung in eine wässrige und organische Phasen enthaltendes Lipid 9,10 erleichtern. Komplexe Lipidklassen von Interesse aus der Gesamtlipidextrakt durch Festphasenextraktion (SPE) getrennt werden. Dieses Trennverfahren eluiert Lipidklassen auf der Grundlage ihrer Polarität oder Bindungsaffinität. Triacyglycerols (TAG) und Cholesterinester (CE) zunächst als Kombinationsanteil, weitere Klassen, Phosphatidylcholin (PC) eluiert, Phosphatidylethanolamin (PE), und nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA), indem die Polarität der Elutionsmittel eluiert . Die Trennung der TAG von CE nutzt die Bindung von TAG nur zu einem frischen SPE cartridge, so dass CE eluiert werden. TAG kann dann durch Erhöhen der Polarität des Lösungsmittels 9,10 Elution eluiert werden. Diese Verfahren können mehrere Proben gleichzeitig mit einer höheren Ausbeute als getrennt werden mit Dünnschichtchromatographie erreicht, was bedeutet, dass relativ klein Proben (z. B. <100 ul Plasma oder Serum, <100 mg Gewebe) können analysiert werden 11,12.

GC ist eine gut etablierte Technik zuerst in den 1950er Jahren beschrieben, wurde vorgeschlagen, dass die mobile Phase in der dann Flüssigkeit-Flüssigkeit-Systeme können mit Dampf ersetzt werden. Es wurde ursprünglich für die Erdöl-Analyse verwendet, aber schnell in anderen Bereichen, wie Aminosäureanalyse und Lipidbiochemie, die immer noch von besonderem Interesse erweitert. Fortschritte in der GC und Technologie wie die Entwicklung von Kapillarsäulen von den bisher verwendeten Füllkörper hat unseren derzeitigen Techniken, bei denen Fettsäuren sind in der Lage zu sein, führteeffizienter bei niedrigeren Temperaturen, was zu GC routinemäßig verwendet werden, um in einer Vielzahl von Untersuchungen 13 identifizieren und zu quantifizieren Fettsäuren getrennt.

GC benötigt Fettsäuren zu, damit sie ausreichend flüchtig, um bei vernünftigen Temperaturen ohne thermische Zersetzung eluiert werden können derivatisiert werden. Dies beinhaltet gewöhnlich die Substitution einer funktionellen Gruppe Wasserstoff enthaltenden Ester, Thioester oder Amide, zur Analyse zu bilden. Methylester sind häufig Derivate untersucht, die durch Methylierung hergestellt werden. In diesem Verfahren werden die Esterbindungen in komplexen Lipiden hydrolysiert, um freie Fettsäuren, die transmethyliert zu Fettsäuremethylester (FAME) bilden freizugeben. Das resultierende Profil der FAME GC bestimmt wird, wird als die Fettsäurezusammensetzung bezeichnet und kann leicht zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen 9,10 verglichen werden. Die Technik ermöglicht sowohl die Anteile der einzelmanuelle Fettsäuren und deren Konzentrationen zu messen.

Neben der Verwendung von GC analysiert Fettsäuren in der Ernährung Studien und in der Lebensmittelindustrie, kann die Technik für eine Vielzahl von Analysefeldern verwendet werden. Zum Beispiel, Umweltanalysen mit GC sind die Bestimmung von Wasserverunreinigungen durch Insektizide und Bodenanalysen Messchlorgehalt. In der Toxikologie hat GC auch verwendet, um illegale Substanzen in Urin-und Blutproben von Personen zu identifizieren, wie ein Sport-Leistungsförderer 12 und die Fähigkeit, komplexe Mischungen von Kohlenwasserstoffen zu trennen macht diese Technik beliebt in der Erdölindustrie für petrochemische Analyse 12.

Schwangerschaft mit signifikanten Änderungen der Fettsäurezusammensetzung von mütterlichem Gewebe, insbesondere des Gehalts an Omega-3 (n-3) und Omega-6 (n-6) polyungesättigten Fettsäuren aci zugehörigends (PUFA) 3. In der aktuellen Studie, veranschaulichen wir die Verwendung von GC in der Messung der Fettsäuren durch die Beschreibung seiner Verwendung in der Analyse der Fettsäurezusammensetzung von Lebergewebe aus Jungfrau und trächtige Ratten Fett niedrigen und hohen Diäten mit verschiedenen Ölquellen gespeist übernommen. Die experimentellen Diäten hier vorgesehen waren eine fettarme Sojaölbasis Diät, eine fettreiche Sojaöl-Diät (130,9 g Gesamtfett / kg Gesamtfett) oder eine hohe Fett-Leinöl-Diät (130,9 g Gesamtfett / kg Ernährung) für 20 Tage zur Verfügung gestellt. Der vollständige Nährstoff und Fettsäurezusammensetzung dieser Diäten wurden zuvor 14 beschrieben. Die Sojaöl-Diäten sind reich an Linolsäure (18.02 n-6) und enthalten eine α-Linolensäure (n-3-18.03 Uhr), während der Leinöl-Diät ist reich an α-Linolensäure. Diese fettreiche Ernährung repräsentieren unterschiedliche Rationen von Linolsäure zu α-Linolensäure (Ration von 8:1 und 1:1, jeweils). Das Verfahren zur Isolierung einzelner Lipidklassen und Analyse durch GC ist, dass wirll entwickelt und validiert, und hat vorher 10, aber ohne detaillierte technische Beschreibung hier gefunden veröffentlicht.

Protocol

1. Tierverfahren Alle Tier Arbeiten sollten in Übereinstimmung mit den Home Office Tiere (Scientific Procedures) Act (1986) durchgeführt werden. Mate-Wistar-Ratten im Alter von 10 Wochen alt von monogamen Zucht, und bestätigen Schwangerschaft durch das Auftreten einer vaginalen Stecker. Nehmen Sie dies als ein Tag der Trächtigkeit und beginnen experimentelle Ernährung. Für jungfräulichen Weibchen, jedes Haus individuell Ratte, und beginnen experimentelle Ernährung. Nach Fütterung …

Representative Results

Der Erfolg dieser Methode hängt von genau nach dem Protokoll und auf die saubere Lösemittel und Reagenzien, um "Lärm" und Verunreinigungen, die auf einem Chromatogramm erscheinen können reduzieren. Kontaminierten Proben sind schwieriger zu analysieren, eine Senkung der Genauigkeit der Fläche unter der Kurve Berechnungen. Wenn das Protokoll erfolgreich ein Chromatogramm mit klaren symmetrischen, gut definierte Höhen und mit minimalem Hintergrundgeräusche gefolgt sollten erhalten werden, wie in Ab…

Discussion

Gas-Chromatographie ist eine genaue Technik, um für die Fettsäureanalyse zu verwenden, und die hohe Reproduzierbarkeit hält diese Technik für die klinische Analysen. Falls GC-Säulen verwendet werden, um die Identifizierung der Fettsäuren von Interesse zu ermöglichen, die verfügbaren Spalten mit Variationen in der Polarität der stationären Phase, Säulenlänge und Innendurchmesser. Die Verwendung einer Quarzglas-Kapillarsäule in dieser Analysemethode eine gute thermische Stabilität und eine hohe Reproduzierba…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten den Beitrag von Meritxell Romeu-Nadal in die Studie an Ratten bestätigen.

Materials

Methanol: Fisher Scientific M/4056/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Chloroform: Fisher Scientific C/4966/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
BHT: Sigma- Aldrich W218405 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous
NaCl Sigma- Aldrich S9888 Anhydrous
Hexane Fisher Scientific H/0406/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Glacial acetic acid Sigma- Aldrich 695084 'CAUTION' Burns – 99.85%
Sulfuric acid Sigma- Aldrich 339741 'CAUTION' Burns – 99.999%
Potassium carbonate Sigma- Aldrich 209619 99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate Sigma- Aldrich 237205 99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10204340 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied
Toluene Fisher Scientific T/2300/15 'CAUTION' Fumes
Diethyl ether Sigma- Aldrich 309966 'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder BOC 44-w 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges Agilent 12102014 Cartridge – Bead mass 100mg
Silica gel SPE cartidges Agilent 14102010 Cartridge – Bead mass 100mg
Molecular seives Sigma- Aldrich 334324 Pellets, AW-300, 1.6mm
Glass pasteur pipettes Fisher Scientific FB50251
Borosilicate glass test tube Fisher Scientific FB59527 Non-screw cap
Screw thread glass test tubes Fisher Scientific FB59555 13mm
Caps for screw thread test tubes Fisher Scientific FB51353 To fit 13mm tube
Solida phase extraction (SPE) tank Agilent VacElut 20 Manifold
Luer stopcocks for SPE tank Agilent 12131005
Vacuum pump Sigma- Aldrich 2656-194GB-1EA
GC vials Kinesis STV 12-03TS Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert
GC vial lids Kinesis SCC09-0.2B Short thread 9mm blue
GC inlet liners SGE Analytical science 092002 Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm
GC septa SGE Analytical science 041856 11mm, MN material
GC column SGE Analytical science 054612 Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm
Gas chromatograph HP 6890 series

References

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Cite This Article
Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. E., Burdge, G. C., Calder, P. C. The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy. J. Vis. Exp. (85), e51445, doi:10.3791/51445 (2014).

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