הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO
Summary
To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.
Abstract
Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.
Introduction
הבדיקה היסטולוגית של רקמות ביולוגיות היא גישה בסיסית בהבנת טבעו של מולקולות / תאים בהקשר הטבעי שלהם. באופן אידיאלי, הדמיה ברזולוציה גבוהה של כל האיבר היא אינפורמטיבי ורצוי ביותר. מכיוון שהאור יש לו עומק חדירה מוגבל, בשל פיזור 1, איברים קבועים צריכים להיות מחולקים על מנת לבצע הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה. לפיכך, רוב מחקרי היסטולוגיה מבוצעים על סעיפי רקמות כמה שמייצגים רק חלק קטן מהאיבר. בחלק מהמחקרים, למשל, אלה במטרה לאתר את קשרים עצביים במוח או בחוט השדרה, כל חלקי הרקמות מאברי המטרה נאספים וצלמו לשחזור 3D. עם זאת, יש חתך רקמות וההדמיה הבאה של קטעים בודדים מגבלות שונות. אלה כוללים זמן להיות רב ומובילים לשחזור 3D לא מושלם של הרקמה, עקב עיוותים מכאניות וקשהies ביישור של התמונות שהתקבלו.
לאחרונה, איברים שקופים ללא פגע סליקה וההדמיה פותחו כפתרון משמעותי לזה חסרון 2,3. עם הקרחת, כל האיבר הוא שניתנו שקוף המאפשרים את אור ההדמיה לנסוע מקצה לקצה (איור 1) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של איבר unsectioned באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר כגון מיקרוסקופ או פוטון אור גיליון רב ( איור 2). קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולי סליקת רקמה חדשים כדי להיות מסוגל תמונת רקמת עניין שלהם למטרות שונות. אלה כוללים ממס אורגני 2-5, 6,7 המים ואלקטרופורזה 8 פרוטוקולי סליקה מבוסס. ביניהם, הדמיה 3 ממדים של ממס פינתה איברים או 3DISCO הוא פרוטוקול ישים בקלות על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל מערכת עצבים מרכזית איברים (CNS), איברים חיסוניים וגידולים מוצקים. בadditיון, ניתן לשלב אותו עם שיטות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופ אור גיליון הקרינה (LSFM), פוטון רב ומיקרוסקופי סריקת לייזר confocal. 3DISCO מבוסס על ניקוי עם חומרים כימיים זמינים ולא יקרים כגון tetrahydrofuran (THF) ואתר dibenzyl (DBE) 4. כל הפרוטוקול יכול לקחת קצר ככל 3-4 שעות. לפיכך, 3DISCO היא טכניקה חזקה ומהירה בהשוואה לשיטות מסורתיות היסטולוגית שעשויים להימשך שבועות עד חודשים כדי להשלים 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות ניקוי רקמות מטרתם להפחית את הפיזור של ההדמיה אור על ידי מדדי השבירה של שכבות רקמה שונות המתאימות באיברים מסומן. כתוצאה מכך, אור ההדמיה יכול לחדור עמוק לתוך רקמות ולגרות את התאים / מולקולות שכותרתו. הרעיון הישן הזה של רקמת ניקוי 17 זכה לתשומת לב הולך וגדל לאחר היישום הראשון המתוחכם של הטכניקה על מוח עכבר בשלמות על ידי Dodt ועמיתים 2. מאז, יש רשימה הולכת וגדלה במהירות של שיטות סליקה חדשות כולל 3DISCO, SCA / דואר, ClearT2, בהירות וSeeDB 3,4,7,18-20. בעיקרו של הדבר, כל מה שהם שואפים להפוך את האיברים שקופים להדמית רקמות עמוקה על ידי שמירה על תווית הניאון. ביניהם, 3DISCO בולט כאחת השיטות פשוטות ולשעתק ביותר. זה לעומת מהיר יחסית לשיטות אחרות סליקה שהוזכרו לעיל (1-5 ימים לעומת 2-3 שבועות למוחות בוגרים, בהתאמה) 21. זה כבר היה הצלחהמיושם באופן מלא לאיברים שונים כגון המוח, חוט השדרה, בלוטות לימפה, טחול, ריאות, גידולים מוצקים, לבלב, ובלוטות החלב 3,4,9. בנוסף, מספר פרסומים על ידי קבוצות מחקר עצמאיות שכבר השתמשו בשיטה זו כדי להשיג תוצאות ההדמיה 22,23. עם זאת, נהלי סליקת רקמות שונים יכולים להיות יתרון עבור תנאים שונים. לדוגמא, בעוד SCA / דואר וSeeDB חלים הטובים ביותר על רקמות עוברי 6,7, הם שיטות סליקה על בסיס מים, שיכול להיות קל יותר לטפל במהלך הדמיה. לעומת זאת, בהירות היא שיטת סליקה מסובכת ויקרה. אבל זה יכול להיות יתרון בהקשר של תיוג נוגדן, בעיקר ברקמות גדולות כגון מוח 8.
השלב הקריטי ביותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהדמית 3DISCO הוא תיוג רקמות, שנעשה לפני סליקת הרקמות. זה חיוני כדי להתחיל עם אות הניאון החזקה ביותר האפשרית. זה יכול bדואר שהושג בדרכים שונות, כולל ביטוי מהונדס של חלבוני ניאון, התחקות על ידי צבעים סינטטיים, transfection הנגיפי או תיוג נוגדן. יש לזכור כי כל הליך סליקה יפחית את אות הניאון של הרקמות. לפיכך, אם אות הניאון היא לא מספיק חזקה בהתחלה – כלומר הוא לא ניתן לגילוי בקלות לפני הסליקה ההדמיה של הרקמות פינו יספק תוצאות עניות.
ישנן מספר מגבלות סליקת שיטות שמחכות לשיפורים. מגבלה קריטית היא שמאז ריאגנטים סליקה לשנות את המבנה של האיברים התפזרו, הם לא יכולים לשמש ברקמה חי. לפיכך, יש לבצע ניסויים כגון עם mEos2 photoactivatable 24 לפני תיקון והסליקה. על הסליקה, הדמיה ברזולוציה סופר של אות הניאון מחלבונים בהירים וphotostable הופכת לאפשרית. בנוסף, בגלל פרוטוקול הסליקה פוחתאינטנסיביות של חלבוני הניאון, לא ניתן לאחסן האיברים פינו לתקופות ממושכות. חשוב לציין כי חלק מהאיברים הם יותר קשים להיות מסומנות. במיוחד, אם האיברים גזורים לשמור על כמויות גבוהות של תאי דם (למשל, טחול, כבד), שהם קשים יחסית כדי לנקות ותמונה. זה גם יחסית קשה יותר להשגת סליקה מלאה לרקמות גדולות, כגון מוח מכרסם מבוגר. רקמות כגון ייתכן שתצטרכנה פעמים דגירה ארוכות יותר, אשר יכולה, מצד שני, להפחית את אות הניאון. בנוסף, פיתוח של שיטות מיקרוסקופית שיכול איברים גדולים ושקופים תמונה בבת אחת ברזולוציה גבוהה הוא צורך מחכה שיפנו אליו. מגבלה נוספת חשובה של הטכניקה היא תיוג רקמות. בעוד אות ניאון חזקה באמצעות ביטוי גנטי או וירוס היא אידיאלית, לא בכל תא או מולקולה יכול להיות מתויג גנטי או באופן ויראלי. מצד השני, תיוג נוגדן של רקמות עבות הוא לא הליך פשוט או אפילו לא פוssible ברוב המקרים. זה אולי צריך פרוטוקולי permeabilization מיוחדים וזמני דגירה ארוכה (מספר ימים עד מספר שבועות) 3. כמו כן, חשוב לזכור כי הרקמות להתכווץ ~ 20% בכל ממד (נמדד לרקמת חוט השדרה) לאחר ניקוי בעיקר עקב התייבשות וdelipidation. הצטמקות זו מתרחשת ratiometrically וצריכה להיות מתוקנת בצעדי כימות. כפי שנצפה בתוצאות שהוצגו, המבנים שכותרתו fluorescently נותרו על כנן, המהווה את אינדיקציה לתקינות חלבון ברקמות מסומנות. בגלל האופי ההידרופובי של הרקמה פינתה הסופית, זה לא יכול להיות מוכתם נוסף עם נוגדנים או מוטבע בפתרונות מים המכילים למשל, Focusclear-המשמש בגליצרול CLARITY-או 80%. לבסוף, זה אתגר לנתח גדלים מכריעות של נתוני הדמיה. לדוגמא, כאשר המוח עכברי כולו נסרק ברזולוציה סלולרית, זה יהיה קשה מאוד להתחקות אחר ולכמת str הרצויuctures (למשל, עצבי או רשתות גליה) ולהשוות על מדגמים שונים באופן אוטומטי. לסיכום, בעוד שחוקרים שואפים לגלות שיטות סליקה חדשות, האתגרים השונים לעיל (קושי בניקוי רקמות מגוונות, הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים גדולים יותר, וניתוח נתונים מסובך) יש לשפר במקביל.
לסיכום, טכניקות ניקוי רקמות שפותחו לאחרונה, כולל 3DISCO, אלגנטיות להוכיח כי 3D הדמיה ברזולוציה גבוהה של איברים שלמים עכשיו זה אפשרי. שימוש בשיטות אלה, מדענים יכולים להשיג מידע האנטומי של תאים ומולקולות באיבר שלם. מחקרי אלה חלוצי 3D הדמיה על איברים שקופים לעורר מספר גדל והולך של חוקרים לפענח אנטומי מורכבות וארגונים מולקולריים של רקמות / איברים בהית ומחלות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג Højer לקריאה ביקורתית של כתב היד, ב 'ינגול (Genentech) להשתתפות בקריינות תסריט, נ' ביין-Ly על שיתוף החוויה של הדמיה כלי דם משופרת עם הזרקה לוריד זנב של צבע לקטינים, ו-M Solloway (Genentech ) לעכברים משמשים בהדמיה לבלב. שורת ה-GFP-M נוצרה על ידי ג 'יי סאנס (אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) ועכברי CX3CR1-GFP על ידי ר' ליטמן (NYU). העבודה נתמכת על ידי Genentech, Inc
Materials
| Thy-1 GFP (GFP-M) mouse | can be obtained from Jackson | ||
| CX3CR1 GFP mouse | can be obtained from Littman lab at NYU | ||
| TgN(hGFAP-ECFP) mouse | can be obtained from Jackson | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7917-16 | |
| NaH2PO4 | (Mallinckrodt, 7892-04) | ||
| 2-2-2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 152463 | used to prepare Avertin solution |
| Saline | Braun | ||
| Tetrahydrofuran | Sigma | 186562-12X100ML | |
| Dichloromethane | Sigma | 270997-12X100ML | |
| Dibenzyl ether | Sigma | Sigma, 108014-1KG | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197-100ML | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | |
| Lectin FITC | Sigma | L0401-1MG | |
| anti-CC10 | Santa Cruz | SC-9772 | 0.388888889 |
| Heparin | APP pharmaceuticals | 504001 | used in perfusion |
| Glass vials | VWR | 548-0554 | |
| Forceps | FST | 11251-10 | |
| Mini Rotator | VWR | 100498-878 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| 100mL Media Storage Bottles | Kimax Media Bottles | EW-34523-00 | |
| Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head | Gilson, Inc | F110701 and F117606 | |
| Microscopy slide | VWR | 48311-703 | |
| FastWell | Grace Bio-Labs | FW20 | |
| Cover slip | Corning | 2940-245 | |
| Glass petri dish | Corning Pyrex | 3160-101 | |
| Dental cement | Lang Dental | 1223PNK | |
| Quantofix Peroxide Test Strips | Sigma | 37206 | |
| Amira with RT resolve microscopy module |
Visage Imaging | image analysis software | |
| Imaris | Bitplane imaging | image analysis software | |
| ImageJ | NIH | freeware |
References
- Tuchin, V. . Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
- Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
- Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
- Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
- Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. , (1903).
- Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
- Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer’s disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
- Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich’s ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
- Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
- Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
- Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).
