בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות של DKFZ. זהירות: כדי למנוע זיהום RNase של דגימות, לנקוט באמצעי זהירות בסיסית למניעת הזיהום RNase ולהכין את כל המאגרים במי DEPC שטופל. 1. הכנת עירובי סוכרוז הכן 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 ופתרונות סוכרוז 50% (ראה טבלה 1). התחל בהכנה על ידי הוספה הדרגתיים לאט 2 מיליליטר של 50% תמיסת סוכרוז לחלק התחתון של צינור ultracentrifuge polyallomer. להקפיא את השכבה על ידי הנחת צינורות עבור 20 דקות ב -80 ° C. הוסף את השכבות הבאות בהפחתת אחוזי סוכרוז בצעדי הקפאה שביניהם, שהסתיימה עד סוכרוז 17.5%. שמור הדרגתיים על קרח במהלך תוספת של פתרונות סוכרוז כדי למנוע הפשרה של שכבות שמתחת. הכן הדרגתיים סוכרוז טרי יום אחד לפני השימוש ולשמור על 4 ° C. Alternatively, להכין הדרגתיים מראש, חנות ב -80 מעלות צלזיוס והפשרה על 4 מעלות צלזיוס בלילה שלפני הניסוי. 2. הכנת רקמה (כבל ו / או מוח השדרה) הרדימי עכבר על ידי מנת יתר של Xylazin וKetamin בNaCl וtranscardially תנקב עם 20 מיליליטר של התמיסה של האנק מאוזן מלחים (HBSS) המכילה 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר שמשתק את הריבוזומים בתמלילים קשורים. לאשר הרדמה נכונה על ידי אי – היענות לצובט הבוהן. לחלץ רקמות במהירות. פתח את dorsally הגולגולת ולחלץ את המוח. בצע laminectomy של כל בית החזה ועמוד השדרה המותני ולחלץ את חוט השדרה. השתמש במוח כולו (~ מ"ג 400) או חתיכת חוט השדרה (~ מ"ג 90) 4 סנטימטר, בהתאמה. העבר את הרקמה לתוך מאגר המגון קר כקרח (ראה טבלה 1) (בחוט השדרה: 1 מיליליטר; מוח: 4 מיליליטר) וקוביות לחתיכות קטנות עם אזמל נקי כדי לאפשר ספיגה מוגברת של cycloheximide. Perfo rm כל צעדים נוספים על קרח. דגירה במשך 15 דקות וhomogenize רקמה באופן מכאני באמצעות homogenizer Dounce. המגון מבוקר בקפידה יש ​​צורך להבטיח שגרעינים יישארו ללא שינוי. לטפל בכל הדגימות בדיוק באותו אופן, כדי להבטיח השוואתיים. הערה: לרקמת מוח: לשבש את רקמה על ידי 5 משיכות עם העלי בחוזקה הולם. לרקמה בחוט השדרה: לשבש ידי 5 משיכות עם העלי רפוי, ואחרי 5 משיכות נוספות עם העלי בחוזקה הולם. קח aliquots (400 μl למוח ו200 μl לחוט השדרה), הקפאת הבזק ולאחסן ב -80 ° C לסך בידוד RNA. הסר את הגרעינים ותא בלא הפרעה ושברי רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 500 10 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה במהירות נמוכה מונעת אובדן של הריבוזומים. ברי Lyse קרום בsupernatant בחינם הגרעינים ל30 דקות על ידי הוספת NP-40 וחומרי ניקוי deoxycholate נתרן (כל אחד לריכוז סופי של 1%). <p class="Jove_title"> 3. הנפקה המיאלין צעד זה מסיר רכיבי שומן מן המדגם שאחרת יהיה להסוות את האות בפרופיל polyribosome. ראשית, דליים מראש צינת ultracentrifuge והרוטור על 4 מעלות צלזיוס ולהכין 2 M, 1.1 M ופתרונות סוכרוז 0.9 M (ראו טבלה 1). מערבבים lysate עם 1.22 כרכים של 2 תמיסת סוכרוז M ולהעביר לתוך צינור ultracentrifuge פוליאתילן. למלא את כל הצינורות לנפח שווה של 10 מיליליטר עם 1.1 M תמיסת סוכרוז, לאחר מכן כיסויו בזהירות עם 0.9 M תמיסת סוכרוז. מניחים את צינורות ultracentrifuge לסלים ultracentrifuge טרום צוננים. צנטריפוגה במשך 3 שעות ב 100,000 XG ב 4 ° C. במהלך תהליך זה הריבוזומים להיות מופקד בגלולה ואילו רכיבי שומן יצופו למעלה ויישארו בsupernatant. 4. סוכרוז Gradient היפוך חלוק הסר את supernatant ו לפזר גלולה במאגר הומוגניזציה ב '(ראה טבלת מס' 1 </strong>). מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר עבור כל דגימה באמצעות Nanodrop או מכשירים שווי ערך ולנרמל את הכמויות כדי לטעון לפי הערך ספיגת. הנח הדרגתיים סוכרוז (הכנה מתוארת בסעיף קודם) לתוך דליי ultracentrifuge טרום צוננים. דגימות שכבה בזהירות על גבי השיפוע. הוספת שיפוע סוכרוז ריק אחד כמו שליטה טכנית. התאם את המשקל של כל אחד מהסלים עם חיץ הומוגניזציה. צנטריפוגה דגימות ל1.5 שעות ב285,000 XG ב 4 ° C. להתחיל בהכנות דקות ISCO fractionator 30 לפני סוף צנטריפוגה. אם דגם אחר של fractionator משמש, בצע את הפרוטוקול של היצרן. הגדר את הרגישות המתאימה (0.2 AUFS למוח או 0.05 AUFS לחוט השדרה) למנורת UV ולעבור אותו לחימום. להרכיב את מדקר הצינור, לחבר אותו באמצעות המשאבה מתגלגלת 60% תמיסת סוכרוז דרך מדקר הצינור. בדוק את ההתקנה על ידי שאיבת סוכרוז (זרימת עכברושדואר: 1 מיליליטר / דקה), ובמיוחד לוודא שאין דליפות בtubings אשר להכניס בועות לתוך השיפוע. קליטת רקע ריקה על ידי שאיבה ידנית חיץ שיפוע לתוך גלאי UV ותיקון קו הבסיס. מוציא בזהירות את דליי ultracentrifuge המכילים סוכרוז הדרגתיים עם דגימות משקעים מהרוטור ומניח אותם על קרח. הימנע מכל הקפצת של הדרגתיים על מנת למנוע אובדן של רזולוציה. הדרגות לרוץ על fractionator. הפעל הדרגות ריקות ראשון להעריך ספיגת רקע ולהבטיח התקנה טכנית מתאימה. צרף שיפוע לגלאי UV ולנקב את החלק התחתון של הצינור עם מדקר הצינור. התחל את השאיבה של סוכרוז 60%, שתחליף את השיפוע עם דגימות משקעים כלפי מעלה דרך גלאי UV ולתוך מתקן הטיפה. הספיגה ב 260 ננומטר מתועד על מנת ליצור את פרופיל הקליטה לדוגמה, עם פסגות מציינות sedimentation של mRNAs הקשורים ליחידות משנת ריבוזומלי, monosomes, ולאחר מכן מספר גדל והולך של הריבוזומים. לאסוף דגימות ל20 שברים באמצעות מתקן הטיפה (600 μl כל אחד, ב2 צינורות מיליליטר). 5. בידוד RNA מן הברים בודדים הוספת SDS 10% לריכוז סופי של 1% לשברים פרט ומערבבים היטב על מנת להתפתח חלבונים ולנתק הריבוזומים. בשלב זה ניתן להקפיא דגימות ב -80 ° C. בהתאם לשאלה יש לטפל, ניתן ונקווה שברים בהתאם לפרופיל הספיגה. בודד RNA עם מיצוי פנול / כלורופורם חומצי, אשר גם מסיר עקבות זיהום של ה-DNA. הוספת נפח אחד של פנול / כלורופורם חומצי (prewarmed לRT) לכל דגימה, חום 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס ולחץ שחרורו מתחת למכסת מנוע קטר לאחר מכן. צנטריפוגה דגימות עבור 20 דקות ב 17,000 XG ב RT. בזהירות העברת שלב מימית ל1.5 מיליליטר חדשצינור. להיות מודע להיפוך שלב בשברי סוכרוז צפופים, שבו השלב המימית עשוי להיות בתחתית לאחר צנטריפוגה. הוספת נפח אחד של isopropanol, 1/9 אצטט נפח נתרן (pH 5.2) וGlycoblue μl 1 לכל דגימה על מנת לזרז RNA. שמור דגימות שעה לפחות 1 ב -80 ° C. צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 17,000 XG ו4 ° C. Glycoblue מספק הדמיה של גלולה. הסר supernatant, לשטוף גלולה פעם אחת עם קרח קר אתנול 80% וגלולים אוויר יבש. ממיסים גלולה במי RNase ללא. לכמת כמות הרנ"א על ​​ידי Nanodrop ולנתח שלמות RNA על ידי שבב Bioanalyzer. RNA אשר מתקבל על ידי הפרוטוקול שהוצג מתאים לכל המצב של מבחני תפוקה גבוהה אמנות כולל microarray ורצף עמוק.