في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة
Summary
يوضح هذا البروتوكول التعديلات الضرورية من polyribosome تجزئة من أجل دراسة translatome في الجسم الحي من عينات الجهاز العصبي المركزي. لأنها تتيح تقييم عالمي للترجمة والنسخ التنظيم من خلال العزلة ومقارنة الحمض النووي الريبي مجموع الكسور إلى الريبوسوم الحمض النووي الريبي ملزمة.
Abstract
وتشارك عدة عمليات في التعبير الجيني بما في ذلك النسخ والترجمة واستقرار mRNAs والبروتينات و. وينظم كل من هذه الخطوات بإحكام، مما يؤثر على ديناميكية النهائية من وفرة البروتين. وجود آليات تنظيمية مختلفة في الخطوة الترجمة، تقديم مستويات مرنا وحدها مؤشرا يمكن الاعتماد عليها في التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، التنظيم المحلية الترجمة مرنا تورطت ولا سيما في وظائف الخلايا العصبية، وتحويل "translatomics 'إلى محور الاهتمام في علم الأعصاب. طريقة عرض يمكن استخدامها لtranscriptomics الجسر والبروتينات.
نحن هنا وصف التعديلات الضرورية لأسلوب polyribosome تجزئة، والتي يستجوب وtranslatome على أساس رابطة mRNAs وتترجم بنشاط لريبوسوم متعددة والترسيب التفاضلية في التدرجات السكروز. تقليديا، والعمل مع عينات في الجسم الحي، وخاصة من سنترال الجهاز العصبي (CNS)، وقد ثبت تحديا نظرا لكميات محدودة من المواد ووجود مكونات الأنسجة الدهنية. من أجل معالجة ذلك، هو الأمثل لبروتوكول صفها خصيصا للاستخدام مع كمية ضئيلة من المواد CNS، كما يتضح من استخدام الماوس واحد الحبل الشوكي والدماغ. لفترة وجيزة، يتم استخراج أنسجة الجهاز العصبي المركزي ويجمد ريبوسوم ترجمة على mRNAs ومع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم تنفيذ المايلين التعويم لإزالة الدهون المكونات الغنية. يتم تنفيذ تجزئة على التدرج السكروز حيث يتم فصل mRNAs وفقا لالريباسي التحميل الخاصة بهم. الكسور معزولة هي مناسبة لمجموعة من المقايسات المصب، بما في ذلك تكنولوجيات فحص الجينوم واسعة جديدة.
Introduction
يتم تحديد الجين التعبير من خلال العمل المشترك من النسخ والترجمة واستقرار مرنا والبروتينات، مع ترجمة تحمل التأثير الأكثر الغالبة 1. ومن الواضح الآن أن كل خطوة من هذه الخطوات هو درجة عالية من التنظيم. الدقيقة الرنا، وتشكيل حبيبات الحمض النووي الريبي، وتذييل بعديد الأدينيلات بديل هيولي هي بعض الأمثلة من التنظيم بعد النسخي التعبير الجيني 2،3. كل من هذه الآليات uncouples النسخ من ترجمة ويؤثر على بروتيوم في النظام البيولوجي في المصالح. وبالتالي، لا يثير الدهشة، ومستويات مرنا وحدها هي قراءات الكمال من مستويات البروتين 4. يوفر البروتينات الكمي التقييم الأكثر مباشرة في التعبير الجيني، ولكن على الرغم من التطورات الأخيرة، لا تزال هناك قيود كبيرة على حساسية ودقة تسلسل البروتين. ولمعالجة translatome، وذخيرة من mRNAs وترجمة، ويقدم حلا وسطا ممتازا بين دراسةTranscriptome على وبروتيوم. وهو أكثر دقة من transcriptomics في تقييم التعبير الجيني النهائي، ويوفر كل من أعلى التغطية والقرار تسلسل من البروتينات.
في نظم الثدييات، فإن غالبية الأحداث تبدأ الترجمة عبر تعتمد على غطاء البدء. مجموعة من العوامل بدء حقيقية النواة مع 40S الوحيدات الريباسي صغيرة التجمع في سقف 5 'من مرنا. المجمع ثم يمسح مرنا وعند الوصول إلى بداية أغسطس كودون، تجند 60S الوحيدات الريباسي كبيرة لتشكيل 80S كاملة الريبوسوم. عائدات مرحلة الاستطالة مع الريبوسوم تتحرك على طول مرنا، مع عوامل استطالة مساعدة إدماج الأحماض الأمينية من tRNAs تحميل لسلسلة ببتيد الوليدة. يمكن ريبوسوم متعددة المضي قدما على طول مرنا واحد في وقت واحد، ولقد ثبت في عدد من الريبوسومات المرتبطة بها لربط مع معدل تخليق البروتين 5،6. وهذا يجعل التحميل الريباسي مؤشرا يمكن الاعتماد عليها لترانslation ويسمح الفصل بين ترجمة بنشاط mRNAs وعلى أساس معدل الترسيب. بالإضافة إلى التحديد الكمي للترجمة mRNAs و، ويمكن الحصول على المعلومات لتحديد تسلسل الزخارف المشاركة في التنظيم الترجمة. الحمض النووي الريبي أيضا البروتينات ملزمة والعوامل الترجمة الأخرى يمكن أن تكون معزولة من كسور مختلفة، وتسهيل دراسة واكتشاف البروتينات التنظيمية ذات الصلة.
في الجهاز العصبي، وقد تم ربط السيطرة متعدية إلى العمليات مثل تخزين مرنا والنقل وتخليق البروتين المحلية. وقد ثبت مخاريط النمو لإيواء بركة محددة المترجمة من mRNAs ومتميزة عن بقية محوار 7. بالإضافة إلى ذلك، محاور امتلاك القدرة على تجميع البروتينات 8،9 محليا. ونتيجة لذلك، السيطرة المحلية على ترجمة أصبح موضوعا حاسما من الدراسة في علم الأعصاب. وقد بينت إمكانية polyribosome من تجزئة للتصدي لهذا في العديد من الدراسات، والتي كانت تستخدم هذه التقنية لالتحقيق في التوجيه محوار في التنمية النخاع الشوكي، وبرهنت على الترجمة التي تعتمد على النشاط من عامل التغذية العصبية في الدماغ 10،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من polyribosome تجزئة ليست تقنية جديدة، إلا أنها تبقى واحدة تحديا من نوع خاص. استنادا إلى المواد المدخلات، ويمكن تحسين كبير يكون ضروريا. هذا هو الحال في الجسم الحي CNS العينات، حيث كمية المواد وغالبا ما يكون القيد ومكونات الأنسجة الدهنية تعوق عزلة mRNAs وترجمة خاصة. البروتوكولات نشرت معظم تجزئة التعامل مع الخميرة أو خطوط خلايا الثدييات، وهناك بروتوكولات المعمول بها للدماغ 12،13،14. في المقابل، هناك بالكاد أي منشورات تصف التجزئة من النخاع الشوكي، والبروتوكولات السابقة تتطلب الحبل الشوكي من عدد كبير من الحيوانات لتكون مجمعة 15. لهذه الأسباب، قدمت عدة تعديلات ضرورية للتكيف مع بروتوكول تجزيء لأنسجة الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك واحدة الماوس الحبل الشوكي. يتم تنفيذ تجميد الريبوسوم مع سيكلوهيكسيميد خلال نضح الحيوانية لتجنب تفكك ريبوسوم الزيتوز عملية طويلة من استخراج الأنسجة. في وقت لاحق، يتم استخراج الرنا polysomal بطريقة محددة لتعظيم العائد polyribosome. الأولى، التي تسيطر عليها تجانس الأنسجة التي كتبها douncing، تحافظ على النواة سليمة ويمنع التلوث الحمض النووي. ثم تتم إزالة نواة موثوق بواسطة الطرد المركزي. مزيج من المنظفات NP-40 و deoxycholate الصوديوم يضمن تحلل من الشبكة الإندوبلازمية والإفراج عن غشاء المرتبطة ريبوسوم لها. بالإضافة إلى ذلك، المكونات التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية داخل المايلين الدهنية الغنية طمس ملامح polyribosome. لذا المايلين تعويم أمر ضروري، حيث يتم مكعبات المركبات الكثيفة مثل polyribosomes ومركبات أخف وزنا مثل المايلين تعويم وتتم إزالة 16. ثم يتم الرسوبية Polyribosomes أكثر من 17.5٪ إلى 50٪ سكروز التدرج. بدلا من طبقات يدويا وتجميد كل طبقة السكروز، التدرجات يمكن أيضا أن تكون مستعدة باستخدام خلاط التدرج. استخراج الحمض النووي الريبي من الكسور باستخدام حمضية الفينول / الكلوروفورم يسمح DNA المراد إزالتها مع فقدان الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، قد تحدث مرحلة انقلاب في الكسور السكروز كثيفة (فوق جزء 16).
يوفر هذا البروتوكول من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب التقليدية التي تعالج مستوى الترجمة. على سبيل المثال، فإن كلا من قياس فسفرته S6 (علامة بارزة الترجمة)، وكذلك وضع العلامات سلاسل الوليدة مع النظائر المشعة إعطاء معلومات عن مستويات الترجمة العالمية ولكن تكشف قليلا على ما يجري على وجه التحديد ترجمتها. Polyribosome تجزئة، من ناحية أخرى، لا يسمح تقييم الترجمة العالمية، ولكن أيضا من هوية ترجمة mRNAs والبروتينات والتنظيمية ذات الصلة. في الوقت الحقيقي PCR الكمي لا يمكن أن يؤديها على الرنا المعزولة عن قراءة سريعة للخروج من mRNAs والمختارة، وميكروأرس والجيل القادم التسلسل الحمض النووي الريبي لا يمكن أن يؤديها للدراسات واسعة الجينوم. تحسينات المقدمة هنا تسمح هذه التقنية ليتم استخدامها مع كميات ضئيلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي يقللجي عدد الحيوانات اللازمة وتحسين نوعية التجريبية الشاملة من خلال تقليل الوقت اللازم لتجهيز الأنسجة. من ناحية أخرى، وهذا الأسلوب لا يمكن التمييز ريبوسوم المتعثرة من ترجمة تلك. والنصوص تحمل ريبوسوم المتعثرة الرواسب في الكسور الثقيلة، وهذا ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تفسير البيانات.
هناك تقنيات حديثة عنها، وهي RiboTaq وفخ، والتي وصفت ريبوسوم مع العلامات حاتمة أو صحفيين على التوالي بطريقة محددة نوع من الخلايا وmRNAs ومعزولة بسبب مناعي 17،18 المرتبطة بها. يمكن أن يقترن هذا الأسلوب لpolyribosome تجزئة لتقديم دقة عالية تلا للسكان خلية معينة. الريبوسوم القدم الطباعة هو أسلوب آخر الرواية التي ينطوي نوكلياز الهضم لتوليد شظايا صغيرة، أو "أقدام"، من mRNAs والتي تحميها ريبوسوم. ثم يتم إنشاء مكتبات من هذه البصمات ومتسلسلا. طريقة هذا الأقليمايديس تحليل الجينوم كله كودون محددة على الترجمة وغير قادرة على تحديد ريبوسوم المتعثرة، غير AUG-بدء الكودونات والمنبع إطارات القراءة المفتوحة الصغيرة، والتي لا يمكن أن يتحقق عن طريق تجزئة polyribosome 19. ومع ذلك، يمكن أن يقترن polyribosome تجزئة إلى التنميط الريبوسوم لعزل شظايا تحتوي على ريبوسوم هضمها واحدة، مما يثري للأنواع الجزيئية اللازمة لإعداد المكتبة التي كثيرا ما هو مطلوب عينة عالية النقاء. أخذت معا، polyribosome تجزئة هي طريقة مرنة مع أهمية دائمة ويمكن أن يقترن لمختلف التطبيقات المصب بما في ذلك فحوصات واسعة الجينوم مثل الجيل التالي من التسلسل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF)، وعلم الأحياء نظم في اشارة الى السرطان (هيلمهولتز التحالف على بيولوجيا الأنظمة) ومركز أبحاث السرطان الألماني (DKFZ).
Materials
| Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
| Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| Equipment | |||
| Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
| Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Lau, A. G., et al. Distinct 3’UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Grolleau, A., et al. Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics. The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).
- Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes. Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).
- Zivraj, K. H., et al. Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs. The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).
- Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110 (2), 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141 (4), 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).
- Lau, A. G., et al. Distinct 3’UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Esposito, A. M., et al. Eukaryotic polyribosome profile analysis. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).
- Chiu, F. C., Smith, M. E. Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination. Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).
- Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. Isolation of myelin. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
- Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
