В естественных условиях допроса центральной нервной системы Translatome по Polyribosome фракционирования
Summary
Этот протокол иллюстрирует существенные модификации polyribosome фракционирования в целях изучения translatome из естественных условиях образцов в ЦНС. Это позволяет глобальную оценку регуляции трансляции и транскрипции через изоляцию и сопоставления общей РНК в рибосоме связанной РНК фракций.
Abstract
Несколько процессов участвуют в экспрессии генов, включая транскрипции, трансляции и стабильность мРНК и белков. Каждый из этих шагов жестко регулируется, влияющие окончательные динамику белка изобилии. Существуют различные механизмы регулирующие на этапе перевода, что делает уровни мРНК один ненадежный показатель экспрессии генов. Кроме того, местные регулирование трансляции мРНК была особенно вовлечены в нейронных функций, сдвигая "translatomics" в центре внимания в нейробиологии. Представленный метод может быть использован для мостовых транскриптомику и протеомики.
Здесь мы опишем основные изменения в технике polyribosome фракционирования, которая опрашивает translatome на основе объединения активно переведенных мРНК к нескольким рибосом и их дифференциальной седиментации в градиенте сахарозы. Традиционно, работать с естественных условиях образцов в, особенно в Centraл нервной системы (ЦНС), оказался непростым из-за ограниченных количеств материала и наличием компонентов жировой ткани. Для решения этого, описан протокол специально оптимизирован для использования с минимальным количеством материала ЦНС, как показано с помощью одной мыши спинного и головного мозга. Вкратце, ЦНС ткани извлекаются и перевод рибосомы обездвижены на мРНК с циклогексимида. Миелин флотации Затем выполняется для удаления липидов богатые компоненты. Фракционирование проводили на градиенте сахарозы, где мРНК разделены согласно их рибосомной загрузки. Изолированные фракции подходят для целого ряда последующих анализов, в том числе новых генома широкий технологий анализа.
Introduction
Экспрессия генов определяется совместным действием транскрипции, трансляции и стабильности мРНК и белков, с перевод принимая наиболее распространенных эффект 1. Теперь очевидно, что каждый из этих шагов является строго регулируется. Микро-РНК, образование РНК гранул, альтернативы и цитоплазматической полиаденилирование некоторые примеры посттранскрипционной регуляции экспрессии генов 2,3. Каждый из этих механизмов отсоединяет транскрипцию с переводом и влияет на протеом в биологической системе, представляющей интерес. Таким образом, неудивительно, уровни мРНК одних только несовершенный отсчет уровней белка 4. Количественный протеомика обеспечивает наиболее прямой оценки экспрессии генов, однако, несмотря на недавние успехи, все еще имеются значительные ограничения на чувствительности и разрешения последовательности белка. Поэтому обращаясь к translatome, репертуар переводе мРНК, предлагает отличный компромисс между изучениятранскриптома и протеома. Это точнее, чем транскриптомику в оценке выражения окончательного гена, и обеспечивает как высокую охват и разрешение последовательности, чем протеомики.
В системах млекопитающих, большинство событий перевода начинают через кэп-зависимой инициации. Группа эукариотических факторов инициации вместе с 40S небольшой субъединицы рибосомы собрать на 5'шапкой мРНК. Комплекс затем сканирует мРНК и по достижении стартовый кодон августа, вербует 60-х годов большой рибосомной субъединицы, чтобы сформировать полный 80S рибосомы. Удлинение стадия протекает с рибосома движется вдоль мРНК, с факторы элонгации содействие включению аминокислот из загруженных тРНК к зарождающейся пептидной цепи. Несколько рибосомы могут идти по одной мРНК одновременно и число связанных с ними рибосом было показано, коррелирует со скоростью синтеза белка 5,6. Это делает рибосомной загрузки надежное указание на переходовslation и позволяет отделить активно переводить мРНК, основанные на скорости оседания. В дополнение к количественному определению перевод мРНК, информацию о последовательности могут быть получены идентифицировать мотивы, участвующих в регуляции трансляции. Кроме того РНК связывающих белков и других факторов перевода могут быть выделены из различных фракций, облегчая изучение и открытие соответствующих регуляторных белков.
В нервной системе, поступательное управления была связана с процессами, такими как мРНК хранения, транспортировки и синтеза локального белка. Конусы роста, как было показано в гавань определенную локализованную пул мРНК, отличных от остальной части аксона 7. Кроме того, аксоны обладают способностью локально синтезируют белки 8,9. В результате, местное управление перевода стала важнейшей темой исследования в области нейробиологии. Потенциал polyribosome фракционирования для решения этой проблемы было проиллюстрировано в нескольких исследованиях, в которых методика была использована дляисследовать аксонов в развитии спинного мозга, и продемонстрировал активно-зависимый перевод BDNF в 10,11 мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя polyribosome фракционирования не роман техника, она остается особенно сложным. На основе исходного материала, существенное оптимизация может быть необходимым. Это особенно характерно для естественных условиях ЦНС образцов в, где количество материала часто является ограничением, и жирные компоненты тканей препятствуют изоляцию переводе мРНК. Часто публикуемые протоколы фракционирования дело с дрожжей или линии клеток млекопитающих, и есть установленные протоколы для мозга 12,13,14. В противоположность этому, существуют только любые публикации, описывающие фракционирование спинной мозг, и предыдущие протоколы требуют спинной мозг из большого числа животных должны быть объединены 15. По этим причинам, несколько существенных изменения были сделаны для адаптации протокол фракционирования для ЦНС тканей, в том числе одним щелчком спинного мозга. Рибосомы иммобилизация с циклогексимида выполняется во животных перфузии, чтобы избежать диссоциации рибосом Даринаг длительный процесс извлечения тканей. Впоследствии полисомной РНК экстрагируют определенным образом, чтобы максимизировать выход polyribosome. Во-первых, контролируемое гомогенизации ткани douncing, сохраняет ядро неповрежденными и предотвращает загрязнение ДНК. Ядро затем удаляют центрифугированием надежно. Сочетание моющих средств NP-40 и дезоксихолата натрия обеспечивает лизис эндоплазматического ретикулума и выпуска его мембранных связаны рибосом. Кроме того, компоненты поглощающие УФ-излучение в пределах богатой липидами миелина скрывать профили polyribosome. Миелин флотации Поэтому необходимо, где плотные соединения, такие как полирибосом осаждают и более легкие соединения, такие как миелина поплавком и удаляются 16. Полирибосом затем осаждали в течение 17,5% до 50% градиенте сахарозы в. Вместо ручного слоев и замораживание каждый слой сахарозы, градиенты могут быть также получены с использованием градиентного смесителя. Экстракция РНК из фракции с использованием кислотного фенол / хлороформ дает DNA быть удалены с минимальной потерей РНК. Однако инверсии фаз может происходить в плотных сахарозы фракции (фракции выше 16).
Этот протокол обеспечивает преимущества по сравнению с другими традиционными методами, которые направлены на уровень перевода. Например, как измерение фосфорилированным S6 (видный маркера перевод), а также маркировка растущих цепей с радиоизотопов дать информацию о глобальном уровнях перевода, но раскрыть немного от того, что конкретно в настоящее время переводится. Polyribosome фракционирование, с другой стороны, позволяет не только оценка глобального перевода, но и о личности переводе мРНК и соответствующих регуляторных белков. Количественный ПЦР в реальном времени могут быть выполнены на изолированных РНК для быстрого считываются из выбранных мРНК, и микрочипы и следующее поколение РНК последовательности может быть выполнена для генома широких исследований. Оптимизации, представленные здесь, позволяют техника, которые будут использоваться с минимальным количеством ЦНС тканей, поэтому сократитьING количество животных, необходимых и улучшение общего экспериментальную качество за счет сокращения времени обработки тканей. С другой стороны, этот метод не может отличить застрявшие рибосомы от перевода из них. Стенограммы несущие зашедших в тупик рибосомы будет оседать в тяжелых фракций, и это следует иметь в виду, при интерпретации данных.
Есть последнюю отчетную методы, а именно RiboTaq и ловушка, в которой рибосомы, меченные эпитопных тегов или репортеров соответственно определенным образом типа клеток и связанных мРНК, выделенных иммунопреципитацией 17,18. Эта техника может быть соединен с polyribosome фракционирования предложить высокое разрешение зачитать для конкретных клеточных популяций. Рибосомы футов печать еще один новый метод, который включает в нуклеазе пищеварение генерировать небольшие фрагменты, или "следы", мРНК, защищенных рибосом. Библиотеки Затем из этих следов и секвенировали. Этот метод провIDES целый анализ генома кодонов конкретного по переводу и способен идентифицировать зашедших в тупик рибосомы, не август начать кодонов и небольшие вверх по течению открытые рамки считывания, которые не могут быть достигнуты к polyribosome фракционирования 19. Тем не менее, polyribosome фракционирование может быть соединен с рибосомами профилирования для выделения переваренных фрагментов, содержащих одиночные рибосомы, таким образом обогащения для молекулярных частиц, необходимых для библиотеки препарата, в котором часто требуется высокая чистота образца. Взятые вместе, polyribosome фракционирование представляет собой гибкий метод с продолжительностью значение и может быть соединен с различных последовательных применений, в том числе генома широких анализов, таких как следующего поколения секвенирования.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF), в системной биологии сигнализации в Раке (Гельмгольц Альянс на системной биологии) и онкологический научный центр немецкой (DKFZ).
Materials
| Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
| Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| Equipment | |||
| Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
| Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Lau, A. G., et al. Distinct 3’UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Grolleau, A., et al. Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics. The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).
- Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes. Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).
- Zivraj, K. H., et al. Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs. The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).
- Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110 (2), 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141 (4), 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).
- Lau, A. G., et al. Distinct 3’UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Esposito, A. M., et al. Eukaryotic polyribosome profile analysis. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).
- Chiu, F. C., Smith, M. E. Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination. Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).
- Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. Isolation of myelin. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
- Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
