デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

1。抗体でコーティングしたカバー予熱し（37℃）RPMI 10％FCS培地30ml及びBDのCytofix / Cytopermを1ml。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の精製された抗体の5μg/ mlの溶液を調製する。 NK92細胞株の活性化のために、抗CD18および抗NKp30のの使用が推奨されます。 PAPペンを使用して＃1.5カバースリップ上の条件ごとにマーク1の約ダイムサイズのサークル。無染色、染色し、デュアル、および2つのステンド条件：デュアルカラー実験のために、四つの条件があるはずです。各領域における抗体溶液200μlを分注し、37℃で30分間インキュベートする。 静かに、室温で50ミリリットルコニカルチューブにPBSを各1 50ミリリットルを浸漬することによってカバースリップを洗ってください。洗浄は、カバーガラス上の抗体の乾燥を避けるために注意すべきである前に、細胞やケアのほかにすぐに発生する必要があります。 2。表紙にNK細胞を活性化スリップ、修正して透過処理条件ごとに5×10 5 NK92細胞を分離。遠心分離機とデカント上清。ステップ1.1から10ミリリットル予め温めメディアで1回洗浄する。遠心分離機とデカント上清。 2.5×10 6 / mlの濃度でステップ1.1から温めておいた培地中の細胞を再懸濁。 優しく1.2.1項で作成した領域の中心に200μLをデカントします。 5％CO 2で20分間37℃でインキュベートする。 （注：この時間は、関心対象の生物学的機能に応じて拡張または減少させることができるNK細胞の顆粒偏光の場合、20分で十分である。）。 細胞のインキュベーション後、穏やかに50mlコニカルチューブ中で室温PBS 50ml中に浸漬することにより、各カバースリップを洗浄する。 徹底的にステップ1.1と渦から温めておいたFIX /パーマ液1mlにトリトンX-100の1を添加する。細胞へのFIX /パーマ液（ステップ2.3）を200μlを加えることによって修正し、透過性に。 10メートルインキュベート室温で暗所での中。 3。染色細胞バッファ染色調製：リン酸生理食塩水（PBS）、1％BSA、0.1％サポニン緩衝。 一次抗体の溶液を調製 200μL 染色緩衝液（ステップ3.1を参照）。 （注：抗体は、使用前に滴定されるべきである）。コー​​ティングするためにカバースリップ（ステップ1.2）を使用したのと同じ種で上昇する一次抗体の使用は避けてください。また、STEDイメージングにStrepatividin – ビオチン結合を避ける。 セクション2.3.1に続いて、優しくバッファを染色50ミリリットル中にカバースリップを洗う。過剰の緩衝液を除去するために綿棒でPAPペン領域のエッジをDAB。セクション3.1.1で作成した抗体溶液を適用します。室温で暗所で30分間インキュベートする。 （推奨：湿度を維持するために、湿ったペーパータオルでスライドボックス内のカバースリップをインキュベート）。 二次抗体の溶液を調製します 200μL 染色バッファ。推奨されるフルオロフォアは、アレクサフルーア488、パシフィックオレンジ、V500です。一般に、1:200希釈のSTEDイメージングに適している。 静かに50ミリリットルの染色バッファにカバースリップを洗う。過剰の緩衝液を除去するために綿棒でPAPペン領域のエッジをDAB。二次抗体溶液を適用する。室温で暗所で30分間インキュベートする。 その他の近隣のタンパク質について、洗浄および染色を繰り返します。ファロイジンでF-アクチンを検出する場合、これは一般に、1:200希釈で、二次抗体に含めることができる。 4。スライド上のマウントカバースリップ封入剤を準備します。注：延長または延長するゴールドが好ましい。それはSTEDと互換性がありませんようにVECTASHIELDは、避けなければならない。ファロイジンを使用する場合は、2,2 – thiodioethanolは避けなければならない。 MOWIOLは許容される。 スライド上のメディアを搭載する約10〜20μLを配置します。反転カバースリップ（セルサイドダウン）とに注意しながら、静かにカバースリップをマウント気泡の導入を避ける。画像化の前に（上カバースリップ）24時間スライドをインキュベートします。 マニキュアでカバースリップの端をシールします。 5。実験セットアップ必要なレーザーとソフトウェアを開始します。 100％パワーでSTED枯渇レーザーを開始する。商用システムの場合には、多くの場合、自動化された手順であるSTEDレーザーを合わせます。 接眼レンズを用いた顕微鏡で、単一のステンド制御をはじめ、サンプルを集中する。 6。設定の最適化第一のチャネルをスキャンし、レーザパワー、励起ビーム位置及び検出レンジを最適化。可能な場合は、> 100の利得を避ける。設定を最適化するために、共焦点画像をキャプチャします。行及び/又はフレーム平均化は、解像度を増加させる。ピクセル飽和を確認してください。注：一部の飽和がSTEDのアプリケーションとして、共焦点に許容される発光の強度が低下します。 STEDのために、最適な画素サイズは30 nm以下のものになるかどうかこれまで良好な分解能は、より小さなピクセルサイズで得られる。撮像される関心領域のサイズは、ピクセルサイズの下限が決まる。小さいピクセルサイズは、光退色を増加させることができる。 50％の枯渇レーザパワーで始まる、STED枯渇ビームとキャプチャイメージを適用する。解像度の向上が見られる場合、より多くの空乏レーザパワーを適用することができる。この段階では、励起用レーザパワー、ライン平均値、および/またはゲインを調整することが必要であり得る。 背景（最小0.3ナノ秒）を低減するためにタイム·ゲーティングを適用します。共焦点上の解像度の向上が見られるまで、設定を調整します。分解能は、半値全幅（FWHM）を推定することによって近似することができる。これは、関心構造を横切ってラインプロファイルを描くことによって作成されたガウスピークの半最大強度での距離を表しており、解像度の推定に広く用いられる方法である。 最初のチャンネルが満足されると、SEの第二のシーケンスを開始シーケンシャルスキャン。一般的には、最初の長波長蛍光団をスキャンすることをお勧めします。第二のチャネル上でのステップ6.1を繰り返します。 両方のスキャンシーケンスで、単一のステンドコントロールを撮像することによりスペクトルの重複がないことを確認してください。軽度のスペクトルの重なりは、可能な限り避けるべきであるが、ソフトウェアでのスペクトル非混合の機能を用いて補正することができる。 7。画像収集画像を取得する。定量的画像化のためには、少なくとも20枚/条件を得ることをお勧めします。正確な数は、しかしながら、そのようなサンプルサイズの計算などの統計的手法と合わせて実験的質問に応じて定義されるべきである。実験を保存します。 8。デコンボリューションデコンボリューションソフトウェアまたはバッチプロセッサを搭載し、開いているファイル。ソフトウェアを使用して、各チャンネルのパラメータを確認してください。各チャネルの励起および発光スペクトル、STED枯渇放出、及び撮像方向を確認たTiON（アップまたはダウン、画像が3次元の場合）特に。 デコンボリューションウィザードを使用してデコンボリューション。デフォルト設定では、しかし、雑音比（SNTR）に信号が蛍光団からの蛍光団に変化し、各チャンネルごとに個別の実験のために決定される必要がある、一般的には十分である。