تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy
Summary
نحن هنا توضيح بروتوكول للتصوير من قبل اثنين من الألوان STED nanoscopy والسامة للخلايا المشبك المناعي للخلايا NK لخص على الزجاج. باستخدام هذه الطريقة نحصل على شبه قرار 100 نيوتن متر من البروتينات المشبك والهيكل الخلوي.
Abstract
الخلايا القاتلة الطبيعية تشكل ينظم بإحكام، المشابك المناعية دقيقا (IS) من أجل ليز الخلايا المصابة فيروسي أو مكون للأورام. ديناميكية الأكتين إعادة تنظيم أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية وتشكيل IS. التصوير من F-الأكتين في المشبك وقد استخدمت تقليديا المجهري متحد البؤر، ولكن الحد حيود الضوء يقيد حل مضان المجهري، بما في ذلك متحد البؤر، إلى ما يقرب من 200 نانومتر. وقد مكنت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير تطوير subdiffraction محدودة فائقة التصوير القرار. من أجل تصور العمارة F-الأكتين في IS نحن ألخص NK السامة للخلايا خلية المشبك من خلال الالتزام خلايا NK لتفعيل مستقبلات على الزجاج. نحن ثم البروتينات صورة ذات الاهتمام باستخدام اللونين استنزاف الانبعاث المستحث المجهري (STED). هذه النتائج في <80 نانومتر قرار في المشبك. هنا نحن تصف خطوات إعداد العينات والحصول على الصور باستخدام عمود مزدوجأو STED nanoscopy لتصور F-الأكتين في NK IS. نحن أيضا توضيح الأمثل من اقتناء العينة باستخدام برامج لايكا SP8 وSTED بوابات الوقت. أخيرا، ونحن الاستفادة هيغنز برامج لمرحلة ما بعد المعالجة deconvolution من الصور.
Introduction
المشبك المناعية هو بيئة معقدة من الإشارات البروتينات والعناصر هيكل الخلية. وقد وصفت المشبك لحل الخلايا أصلا بأنها "الثيران العين" مثل هيكل مع حلقة من الأكتين والتصاق جزيئات المحيطة مجال إفرازية المركزي 1-4. ومع ذلك، ونحن نعلم الآن أنه يتكون من المجالات المجهرية من إشارات النشطة التي تتطلب إعادة تنظيم هيكل الخلية الحيوية المستمر من أجل وظيفة 5-11. استمدت الكثير من المعلومات التي لدينا الآن حوالي المشبك من المجهري، وكانت المناعة الأوائل من تكنولوجيا التصوير المتطورة.
واحدة من هذه التكنولوجيا هو رواية فائقة القرار المجهري. المجهر الضوئي التقليدية محدودة مكانيا من قبل حاجز حيود الضوء، والذي يحدد الحد الأدنى من القرار لجميع المجهري مضان، بما في ذلك متحد البؤر، في حوالي 200 نانومتر. في السنوات الأخيرة، كانت عدة تقنيات المطورد التي تسمح القرار دون حاجز الحيود. وتشمل هذه الانبعاثات التحفيز استنزاف المجهري (STED)، منظم المجهري الإضاءة (SIM)، المجهري حل عشوائيا (STORM)، والمجهر الضوئي photoactivatable (النخيل). وقد تم استعراض هذه التقنيات بالتفصيل في مكان آخر 12-15، ولكن ترد أدناه. يتم إنشاء Subdiffraction القرار محدودة بطرق فريدة من نوعها في كل نظام. اختيار تقنية فائقة الدقة، وبالتالي، يجب أن تمليها التجربة والنظام التجريبي من الفائدة.
ويتحقق القرار السوبر STED باستخدام عالية الكثافة torroidal استنزاف شعاع التي انتقائي "الصمت" مضان حول كل fluorophore من الفائدة التالية الإثارة، مما أدى إلى subdiffraction محدودة المجهري مضان 16-18. ميزة واحدة من STED هو أن الحصول على الصور سريعا ويتطلب القليل نسبيا مرحلة ما بعد المعالجة. في حين أملت اختيار صبغة من المواصفاتموقف ترال من شعاع نضوب، والتي تقع في النظام المتوفرة تجاريا في 592 نانومتر، تتوفر العديد من الأصباغ المتاحة تجاريا التي تجعل مجموعات من اثنين fluorophores ممكن. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم عادة للصحفيين الفلورسنت مثل GFP يمكن تصويرها، مما يجعل التجارب الخلية الحية ممكن 19،20.
وقد استخدمنا في السابق STED لتحديد مناطق hypodensity F-الأكتين التي تستخدم من قبل خلايا NK للتحبب 21،22 وكميا. نقترح أن STED هو خيار جيد لتصوير المشبك المناعي، نظرا لتوافر مرونة نسبيا من fluorophores وتحسين متفوقة في القرار في محور س ص. بالإضافة إلى ذلك، على النظام STED المتاحة تجاريا تستخدم لهذه التجارب، واستخدام سرعة عالية (12،000 هرتز) الماسح الضوئي صدى يسمح لسرعة اقتناء الصور مع الحد الأدنى من الضرر لعينات. وتعتبر مرونة محدودة في اختيار صبغة وضع غير مؤات من STED 12،ولكن اللون المزدوج STED واضح ومباشر نسبيا مع العديد من fluorophores متاحة تجاريا. دمج STED مع المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر يسمح أيضا للتصوير متحد البؤر إضافية في تركيبة مع STED، وذلك في حين STED يقتصر على قناتين، وهياكل إضافية يمكن تصويرها في متحد البؤر مع قرار من حوالي 200 نانومتر (E. الصولجان، والملاحظات غير منشورة ). في حين وصفنا استخدام STED لتصوير الخلايا المناعية، يتم تطبيق هذه التكنولوجيا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، وتصور مجموعة متنوعة من هياكل الخلية 23-26.
يستخدم SIM نهجا مختلفا لتوليد صور محدودة subdiffraction. من خلال وضع تصور أنماط الإثارة الدورية المعروفة، ومن ثم يمكن الحصول على معلومات حول بنية مجهولة تجري دراستها التالية التحول الرياضية 27. هذا ينتج زيادة في القرار إلى ~ 100 نانومتر أفقيا 28،29. ميزة SIM هو أنه طو متوافق مع جميع الأصباغ متحد البؤر القياسية وتحقيقات، ولكن العيب هو أنه أبطأ بكثير للحصول على الصور وهذه تتطلب مطولة مرحلة ما بعد المعالجة 12. وهذا يحد أيضا استخدامه لتصوير الخلايا الحية.
أخيرا، يمكن أن تتولد الصور فائقة الدقة من العشوائية الصور التحول من fluorophores. يتم استغلال هذا النهج في تنشيط الصورة توطين المجهري (النخيل) ومؤشر ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصرية (STORM). عن طريق المسح الضوئي لقطة كاميرا متعددة وتوطين الجزيئات تفعيلها بشكل عشوائي التي تحولت "على" و "خارج" مع مرور الوقت، يتم إنشاء الصور مع قرار 20-30 نانومتر من الأطر المتراكمة 30-32. المفاضلة لهذا القرار هو الوقت اللازم للحصول على الصور.
نحن هنا تظهر، في التفاصيل، وبروتوكول لإعداد وتصوير عينات اللون المزدوج في STED. في هذا النظام، هو الإثارة مع نابض، الانضباطي، ضوء الليزر الأبيض. نظرا لطبيعةمن الإثارة شعاع نابض، يرصد الوقت النابضة الكشف ممكن، والمزيد من الزيادات القرار. بالإضافة إلى ذلك، تم تجهيز نظام مع الجادولينيوم الهجين (HYD) كشف، والتي هي أكثر حساسية من أنابيب مضخم التقليدية، وبالتالي السماح لانخفاض متطلبات الطاقة الليزر. يتم تطبيق شعاع استنزاف لSTED مستمر ويتم ضبطها إلى 592 نانومتر، والتي سوف تملي اختيار الأصباغ المتاحة لهما اللون STED. تركيبات الصبغة المستخدمة عادة تشمل عموما واحد منفعل من قبل 488 نانومتر (مثل اليكسا فلور 488، أوريغون الأخضر، DyLights الأخضر، أو كروميو 488) واحد منفعل من قبل 458 نانومتر (مثل البرتقال أو المحيط الهادئ الأفق V500). وهكذا، في حين كشف عن الأصباغ اثنين سيكون في نطاق مماثل (وكلاهما يمكن الوصول إليها بواسطة الليزر استنزاف)، سوف تحدث الإثارة مع أطوال موجية مختلفة. مع الانضباطي الأبيض ضوء الليزر والانضباطي للكشف عن، وتعظيم إشارة حين القضاء على التداخل الطيفي مصنوع من السهل إلى حد ما. على هذا النحو، كان لدينا نجاح جيدة مع combinatأيونات الأصباغ المتاحة تجاريا، مثل البرتقال والمحيط الهادئ اليكسا فلور 488 (المستخدمة هنا). تم تصميم بروتوكول لدينا نحو ويصف تقييم خلايا NK الإنسان الذي يمثل التركيز التاريخية من مختبرنا. نحن على وجه التحديد استخدام خط الخلية NK92 في هذا المثال لأن ذلك هو واحد ونحن قد طبقت بشكل منتظم في منطقتنا 21،33 العمل التجريبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
فإن التحسن في القرار على أن يعتمد إلى حد ما متحد البؤر على العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها. وتشمل هذه العوامل الانحرافات الطفيفة في سماكة الغطاء زلة والتناقضات في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. فمن المهم للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة في غرفة التصوير متسقة قدر الإمكان، وينبغي إعادة ترتيب شعاع STED تقريبا كل 60 دقيقة. كما ذكر في الإجراءات، ويجب تجنب استخدام VECTASHIELD المتوسطة المتزايدة، وهذا غير متوافق مع STED. بالإضافة إلى هذا، ينبغي للمرء دائما استخدام # 1.5 زلات الغطاء، وإذا كانت متوفرة، استخدام تلك التي تم التحقق منها لسمك معين.
واحد من تعديل النهج وصفها هنا هو صورة قنوات إضافية في متحد البؤر، وذلك باستخدام fluorophores التي تنبعث منها في طول موجة أطول من شعاع STED. بهذه الطريقة، يمكن للمرء صورة يصل إلى أربع قنوات (اثنان في متحد البؤر، واثنان في STED). إذا أخذ هذا النهج، ومع ذلك، فإن قنوات مع fluorophores الإلكترونيةسوف mitting أعلاه استنزاف الليزر STED تحتاج إلى تصوير أول، وتطبيق شعاع STED سوف تستنزف الفوتونات في هذه القنوات. واحدة ميزة لهذه التقنية هو تطبيق من الوقت النابضة، والتي سوف تحسن أيضا في القرار متحد البؤر من خلال القضاء على الانبعاثات من الفوتونات مع أعمار قصيرة 34. على وجه الخصوص، فإن استخدام النابضة الوقت، توقيت كشف الانبعاثات لتتوافق مع الإثارة نابض STED، وانخفاض مضان الخلفية من انعكاس قبالة الزجاج ساترة عند التصوير على مقربة منه. حتى في تجربة لا تصلح للSTED، إذا باستخدام مصدر الإثارة نابض، يمكن للزمن النابضة تكون أداة مفيدة لتحسين القرار في متحد البؤر.
هناك العديد من التعديلات التي يمكن استخدامها لتحسين القرار في STED. واحد هو تقليل حجم الثقب من مستوى 1 إيري حدة، على الرغم من أن هذا سوف أيضا تقليل كمية من الضوء تصل إلى العينة. وهذا يمكن أن يتم تعويضهم عن طريق زيادة لاسإيه السلطة أو تحقيق مكاسب. هو آخر لزيادة خط المتوسط، الأمر الذي سيزيد من كمية المعلومات التي تم جمعها عن كل فوتون، وتحسين القرار. مرة أخرى، ومع ذلك، قد يكون هذا على حساب photobleaching من العينة، لذلك سوف تحتاج إلى التوازن الذي يجب إقامته بين القرار والتبييض. وبالمثل، فإن استخدام البروتينات الفلورية مثل GFP تتطلب التحسين الحذر لتجنب التبييض. ويمكن تحقيق هذا عن طريق تقليل قوة الليزر STED إذا لزم الأمر. نقاط قتا أطول سوف تسمح أيضا لمزيد من الانتعاش والحد من الفوتون التبييض. ينبغي أخذها في الاعتبار تصحيح ل photobleaching ليعيش عند تحليل STED.
بطبيعة الحال، والتصوير في 3 أبعاد في STED الممكن أيضا، وسوف تعطي أيضا تحسنا التصوير متحد البؤر التقليدية. هل هذا صحيح لا سيما إذا كان يتم ذلك بالاشتراك مع deconvolution، على الرغم من الرعاية التي ينبغي اتخاذها لتصحيح الانحراف الذي يحدث أثناء التصوير طائرات متعددة في محور ض. إذا باستخدام برنامج هيغنزلdeconvolve، يتم الحصول على هذا التصحيح باستخدام "استقرار الصورة" الميزة. باستخدام هذا النهج، سيتم تحسين القرار في محور ض. هذا هو تحسنا كبيرا خلال التصوير متحد البؤر التقليدية، التي لديها ضعف القرار المحوري، وحتى على STED نفسها فقط، التي لديها أيضا فقيرة نسبيا القرار ض محور. حين الحصول على أكوام متعددة في STED، يجب توخي الحذر لتجنب التبييض من العينة، وإذا كان أحد يمكن أن تقلل من الضروري الخط المتوسط أو الليزر كثافة الطاقة من أجل القيام بذلك. مرة أخرى، تجدر الإشارة إلى أنه إذا كان التصوير fluorophores الأخرى التي ليست مناسبة للSTED، وتطبيق شعاع نضوب في أول مسح متتابعة من شأنه أن يمنع الانبعاثات من هذه القنوات. وبالتالي، نهج STED / متحد البؤر مختلطة (عند استخدام المسح متحد البؤر في القنوات التي تنبعث منها في طول موجة أكبر من 592 نانومتر) للأسف لن تكون مناسبة ل3D.
لتلخيص، فقد اخترنا STED كنهج بسبب السهولة النسبية المتمثلة في التطبيقlication والتحسن في القرار على التصوير متحد البؤر القياسية. لتصوير المشبك المناعي، فإنه قد ثبت تقنية فعالة وقيمة أن يسمح لنا أن نرى التفاصيل في العمارة F-الأكتين غير ممكن في القرار أكثر من 200 نانومتر. في حين أن العديد من هذه التفاصيل تبدو خفية، فإنها يمكن أن يكون لها تأثير عميق على وظيفة خلايا NK. وبالتالي، نحن نطبق أحدث تكنولوجيا التصوير نانوية لاستخلاص المعلومات التي تعتبر ضرورية للحفاظ على صحة الإنسان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيف دانيلز للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل R01 AI067946 لJSO
Materials
| #1.5 cover slips | VWR | 48393-172 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554722 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Cotton tipped applicator | Fisher Scientific | S450941 | |
| Falcon centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 352070 | |
| Fetal calf serum (FCS) (500 mL) | Atlantic Biologicals | S11050 | |
| Goat anti-rabbit Pacific Orange | Life Technologies | P31584 | |
| Laboratory tissue wipers | VWR | 82003-820 | |
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| NK-92 cells | ATCC | CRL-2407 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A12379 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14190250 | |
| Prolong anti-fade reagent | Life Technologies | P7481 | |
| Purified anti-CD18 | Biolegend | 301202 | |
| Purified anti-NKp30 | Biolegend | 325202 | |
| Purified anti-perforin | Biolegend | 308102 | |
| RPMI 1640 medium (500 mL) | Life Technologies | 11875-093 | |
| Saponin from Quillaja bark | Sigma | S4521 | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 008899 | |
| Triton X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22142 | |
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Huygens deconvolution software | SVI | Contact company | |
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica Microsystems | Contact company |
References
- Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
- Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
- Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
- Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
- Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
- Tonnesen, J., Nagerl UV, . Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
- Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
- Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski, ., Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).
- Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
