JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Published: March 24, 2014
doi:
10.3791/51100
,
1Center for Human Immunobiology,Texas Children’s Hospital and Baylor College of Medicine

Summary

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא.

Abstract

תאי רוצח טבעיים יוצרים סינפסות מוסדרות היטב, מכוון היטב חיסוניים (IS) כדי lyse תאים בנגיף נגוע או סרטניים. ארגון מחדש אקטין דינמי הוא קריטי לתפקוד של תאי NK וההיווצרות של IS. ההדמיה של ה-F-אקטין בסינפסה ניצלה באופן מסורתי מיקרוסקופיה confocal, עם זאת לגבול ההשתברות של אור מגביל את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כולל confocal, כ 200 ננומטר. ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגיית הדמיה אפשרה הפיתוח של הדמיה ברזולוציה סופר המוגבלת subdiffraction. על מנת להמחיש ארכיטקטורת ה-F-אקטין בהוא שאנחנו לשחזר את סינפסה ציטוטוקסיות תא NK על ידי עמידה תאי NK להפעלת קולטן על זכוכית. לאחר מכן, אנו חלבוני תמונה של עניין באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מאולץ בשני צבעים (STED). התוצאה היא <80 ננומטר ברזולוציה בסינפסה. במסמך זה אנו מתארים את השלבים של הכנת מדגם ורכישת תמונות באמצעות col הכפולאו Nanoscopy STED לדמיין F-אקטין בNK IS. אנחנו גם להמחיש אופטימיזציה של רכישת מדגם באמצעות תוכנת SP8 יקה וSTED מגודרת זמן. לבסוף, אנו מנצלים תוכנת הויגנס לdeconvolution שלאחר העיבוד של תמונות.

Introduction

סינפסה החיסונית היא סביבה מורכבת של חלבוני איתות ואלמנטי cytoskeletal. סינפסה cytolytic תוארה במקור כבעל "שוורי עיניים" כמו מבנה עם טבעת של מולקולות אקטין והידבקות סביב תחום הפרשה מרכזי 1-4. עם זאת, עכשיו אנחנו יודעים שזה מורכב מתחומים המיקרוסקופיים של איתות פעילה שדורשים ארגון מחדש cytoskeletal דינמי מתמשך לתפקוד 5-11. חלק גדול מהמידע שיש לנו עכשיו על סינפסה כבר נגזר מיקרוסקופיה, ואימונולוגים היו מאמצים מוקדמים של טכנולוגיות הדמיה חדשניות.

טכנולוגיה חדשנית אחד כזה היא מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. במיקרוסקופ אור הקונבנציונלית מוגבלת מרחבית על ידי מחסום דיפרקציה של אור, אשר מגדיר את הגבול התחתון של רזולוציה לכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כולל confocal, בערך בשעה 200 ננומטר. בשנים האחרונות, כמה טכניקות היו לפתחד המאפשרים ברזולוציה מתחת למחסום העקיפה. אלה כוללים מיקרוסקופיה גירוי פליטת דלדול (STED), מיקרוסקופיה מובנה תאורה (SIM), מיקרוסקופיה stochastically נפתרה (סערה), וכן במיקרוסקופ photoactivatable האור (PALM). טכניקות אלו נסקרו בהרחבה במקומות אחרים 12-15, אבל הם מפורטים להלן. הרזולוציה מוגבלת Subdiffraction מופקת בדרכים ייחודיות בכל מערכת. הבחירה של טכניקה ברזולוציה סופר, ולכן, צריכה להיות מוכתבת על ידי המערכת ניסיונית הניסוי ושל עניין.

ברזולוציה סופר STED מושגת באמצעות קרן דלדול torroidal בעוצמה גבוהה באופן סלקטיבי "שתיקות" הקרינה סביב כל fluorophore העניין הבא עירור, וכתוצאה מכך מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגבל subdiffraction 16-18. אחד יתרונות של STED הוא שרכישת תמונה היא מהירה ודורשת שלאחר עיבוד מועט יחסית. בעוד בחירת צבע מוכתבת על ידי המפרטעמדת tral של קורה האזילה, אשר במערכת זמינה המסחרית ממוקם ב592 ננומטר, כמה צבעים זמינים מסחרי זמינות שהופכים שילובים של שני fluorophores אפשריים. בנוסף, ניתן הדמיה כתבי ניאון נפוץ כגון ה-GFP, מה שהופך את ניסויי תא חיים אפשריים 19,20.

יש לנו שימשו בעבר STED לזהות ולכמת אזורים של hypodensity F-אקטין כי הם מנוצלים על ידי תאי NK לdegranulation 21,22. אנו מציעים כי STED היא בחירה טובה עבור ההדמיה סינפסה החיסונית בשל הזמינות גמישה יחסית שלה של fluorophores ושיפור מעולה ברזולוציה בציר XY. בנוסף, על מערכת STED זמינה המסחרית מנוצל לניסויים אלה, השימוש בסורק תהודה במהירות גבוהה (12,000 Hz) מאפשר רכישה מהירה של תמונות עם נזק מינימאלי לדגימות. גמישות מוגבלת בבחירת צבע נחשבת חסרון של 12 STED,עם זאת צבע כפול STED היא פשוטה יחסית עם כמה fluorophores זמין מסחרי. שילוב של STED עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal גם מאפשר הדמיה confocal נוספת בשילוב עם STED, זאת תוך STED מוגבלת לשני ערוצים, ניתן הדמיה מבנים נוספים בconfocal עם רזולוציה של כ 200 ננומטר (א 'מייס, תצפיות שלא פורסמו ). למרות שאנו מתארים את השימוש של STED הדמיה תאים חיסוניים, טכנולוגיה זו היא ליישם במגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאים עצביים, ומאפשר הדמיה של מגוון מבני תא 23-26.

ה-SIM משתמשת בגישה שונה כדי להפיק תמונות מוגבלות subdiffraction. על ידי הדמיה דפוסי עירור תקופתי ידועים, אז יכול להיות שהתקבל מידע על המבנה ידוע נחקר בעקבות שינוי מתמטי 27. זה מניב עלייה ברזולוציה ל ~ 100 ננומטר רוחבי 28,29. היתרון של ה-SIM הוא שזה אניים תואם את כל צבעי confocal סטנדרטיים ובדיקות, עם זאת החסרון הוא שזה הרבה יותר איטי לרכוש תמונות ואלה דורשים עיבוד פוסט ארוך 12. זה גם מגביל את השימוש בו להדמית תא חי.

לבסוף, יכולות להיות שנוצרו תמונות ברזולוציה סופר על ידי צילום מיתוג סטוכסטיים של fluorophores. גישה זו מנוצלת במיקרוסקופיה לוקליזציה מופעל תמונה (PALM) ומיקרוסקופיה סטוכסטיים שיקום אופטי (STORM). על ידי סריקת מסגרות מצלמה מרובות ולוקליזציה של מולקולות מופעלות באופן אקראי, כי הם הפכו את "על" ו "את" לאורך זמן, תמונות עם הרזולוציה 20-30 ננומטר נוצרות ממסגרות שנצברו 30-32. Trade-off להחלטה זו הוא הזמן הנדרש כדי לרכוש תמונות.

כאן אנו מראים, בפירוט, את הפרוטוקול להכנה ודגימות הדמיה צבע כפולים בSTED. במערכת זו, עירור הוא עם פעמו מתכונן, לייזר אור לבן,. בשל האופישל קרן עירור פעם, gating של זיהוי הזמן מתאפשר ורזולוציה עליות נוספות. בנוסף, המערכת מצוידת בגלאים היברידיים גדוליניום (HYD), שהם רגישים יותר מצינורות מכפיל קונבנציונליים, ובכך מאפשרת לדרישות כוח הלייזר נמוכות יותר. קרן דלדול לSTED מיושמת ברציפות, והוא מכוון ל592 ננומטר, אשר יכתיב את הבחירה של צבעים זמינים עבור שתי הצבע STED. שילובי צבע בשימוש נפוץ בדרך כלל כוללים אחד להתרגש ידי 488 ננומטר (כגון Alexa פלואוריד 488, אורגון גרין, DyLights הירוק, או Chromeo 488) ואחד להתרגש ידי 458 ננומטר (כגון פסיפיק אורנג' או אופק V500). וכך, בעוד זיהוי של שני הצבעים יהיה בטווח דומה (ושניהם נגישים על ידי לייזר דלדול), עירור יתרחש באורכי גל שונים. עם גלאי אור לייזר ומתכונן לבנים מתכונן, למקסם את האות תוך ביטול חפיפה ספקטרלית נעשה קל למדי. ככזה, יש לנו הצלחה טובה עם הקומבינאטיונים של צבעים זמינים באופן מסחרי, כגון פסיפיק אורנג' וAlexa פלואוריד 488 (משמש כאן). הפרוטוקול שלנו מותאם כלפי ומתאר את ההערכה של תאי NK אנושיים כפי שמייצג את המוקד ההיסטורי של המעבדה שלנו. אנחנו במיוחד ניצול שורת תאי NK92 בדוגמא זו שכהיא אחד יש לנו ליישם באופן קבוע ב21,33 העבודה הניסויית שלנו.

Protocol

1. Coverslips מעיל עם נוגדן Prewarm (ב 37 מעלות צלזיוס) 30 מיליליטר של תקשורת FCS 10% RPMI ו1 מיליליטר של BD Cytofix / Cytoperm. הכן פתרון של 5 מיקרוגרם / מיליליטר של נוגדן מטוהר בופר פוספט (PBS). להפעלתו של קו NK92 הסלולרי, השימוש באנטי-CD18 ואנטי NKp30 מומלץ. מעגל מארק אחד כ אגורה בגודל עבור כל תנאי על coverslip # 1.5 באמצעות עט PAP. לניסוי צבע כפול, לא אמור להיות ארבעה תנאים: ללא רבב, מוכתמים כפול, ושני תנאים צבעוניים אחד. לוותר 200 μl של פתרון נוגדן בכל אזור ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לשטוף coverslips ידי בעדינות לטבול כל אחד ב50 מיליליטר של PBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר בטמפרטורת חדר. כביסה צריכה להתרחש מייד לפני התוספת יש לקחת תאים וזהירות כדי למנוע ייבוש נוגדן על coverslip. 2. הפעל תאי NK בכיסויהתלושים; לתקן וPermeabilize לבודד 5 x 10 5 NK92 תאים לכל מצב. צנטריפוגה ולמזוג supernatant. שטפי פעם עם 10 מיליליטר תקשורת prewarmed משלב 1.1. צנטריפוגה ולמזוג supernatant. תאי resuspend בתקשורת prewarmed משלב 1.1 בריכוז של 2.5 x 10 6 / מיליליטר. בעדינות למזוג 200 μl למרכז האזור שנוצר בסעיף 1.2.1. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ב 5% CO 2. (הערה: הפעם ניתן להרחיב או להקטין בהתאם לפונקציה הביולוגית של עניין לקיטוב גרגיר תא NK, 20 דקות מספיקות.). לאחר דגירה של תאים, לשטוף בעדינות coverslips ידי טבילת כל אחד ב50 מיליליטר של בטמפרטורת חדר PBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף 1 μl של טריטון X-100 1 מיליליטר של תמיסת תקן / פרם prewarmed משלב 1.1 ומערבולת ביסודיות. לתקן וpermeabilize ידי הוספת 200 μl של חיץ תקן / פרם (שלב 2.3) לתאים. דגירה של 10 מ 'בחושך בטמפרטורת חדר. 3. תאי כתם הכן מכתים חיץ: פוספט שנאגרו מלוח (PBS), BSA 1%, 0.1% Saponin. הכן פתרון של נוגדן עיקרי 200 μl חיץ מכתים (ראה שלב 3.1). (הערה: הנוגדן צריך להיות טיטרציה לפני השימוש). הימנע מהשימוש בנוגדן ראשוני, כי הוא גדל באותו המין משמש מעיל coverslip (שלב 1.2). כמו כן להימנע קשרי Strepatividin-ביוטין הדמיה STED. בעקבות סעיף 2.3.1, לשטוף בעדינות coverslips ב50 מיליליטר מכתים את החיץ. מורח את הקצוות של אזור PAP-עט עם מקלון צמר גפן כדי להסיר חיץ עודף. החל פתרון נוגדן שנוצר בסעיף 3.1.1. דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. (מומלץ: דגירה coverslips בתיבת שקופיות עם מגבת נייר לחה כדי לשמור על לחות). הכן את הפתרון של שני נוגדנים ב 200 μl הכתמהמאגר. fluorophores המומלץ הוא Alexa פלואוריד 488, פסיפיק אורנג', וV500. באופן כללי, דילול 1:200 מתאים להדמית STED. לשטוף בעדינות coverslips ב50 מיליליטר מכתים את החיץ. מורח את הקצוות של אזור PAP-עט עם מקלון צמר גפן כדי להסיר חיץ עודף. החל פתרון נוגדנים משני. דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. חזור על הפעולה כביסה וצביעה לחלבונים נוספים של ריבית. אם גילוי ה-F-אקטין עם Phalloidin, זה יכול להיות כלול עם נוגדנים משני, בדרך כלל בדילול 1:200. 4. הר coverslips על שקופיות הכן את ההרכבה בינונית. הערה: להאריך או להאריך זהב עדיף. יש להימנע Vectashield, כפי שהוא אינו תואם לSTED. יש להימנע 2,2-thiodioethanol אם Phalloidin משמש. Mowiol מקובל. הנח כ 10-20 μl של הרכבה בינונית בשקופית. coverslip מרחב זה (תא בצד למטה) והר coverslip בעדינות, מקפידלמנוע כניסה של בועות אוויר. דגירה שקופיות עבור 24 שעות (coverslip מעלה) לפני ההדמיה. לאטום קצוות של coverslip עם לק. 5. ניסיוני התקנה ליזום לייזרים ותוכנה נדרשים. ליזום לייזר דלדול STED ב100% כוח. יישר לייזר STED, אשר במקרה של מערכות מסחריות הוא לעתים קרובות הליך אוטומטי. פוקוס המדגם, החל בשליטה יחידה מוכתמת, על המיקרוסקופ באמצעות עיניות. 6. אופטימיזציה של הגדרות סרוק את הערוץ הראשון ולייעל את כוח הלייזר, עמדת קרן עירור ומגוון גלאי. במידת האפשר, להימנע מרווח של> 100. ללכוד את התמונה בconfocal כדי לייעל את ההגדרות. קו ו / או מיצוע מסגרת יגדיל את הרזולוציה. הגעה לרווית פיקסל. הערה: רוויה מסוימות מקובלת בconfocal כיישום של STED יפחית את עוצמת הפליטה. לSTED, גודל פיקסל אופטימלי יהיה מתחת 30 ננומטר איךרזולוציה טובה יותר אי פעם תושג עם גודל פיקסל קטן יותר. גודלו של האזור של עניין להיות הדמיה יכתיב את הגבול התחתון של גודל פיקסל. גדלי פיקסל קטנים יותר עשויים להגדיל photobleaching. החל קורה דלדול STED וללכוד תמונה, החל ב50% כוח לייזר דלדול. אם שיפור ברזולוציה נתפס, יכול להיות מיושם יותר כוח לייזר דלדול. בשלב זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כוח עירור לייזר, ממוצע קו, ו / או רווח. החל gating זמן כדי להפחית רקע (0.3 NSEC המינימום). התאם את הגדרות עד שיפור ברזולוציה מעל confocal ניתן לראות. החלטה יכולה להיות מקורב על ידי אומדן חצי מקסימום רוחב מלא (FWHM). זה מייצג את המרחק בעצמה המקסימלי מחצית משיא גאוס נוצר על ידי ציור פרופיל קו על פני המבנה של עניין, והיא שיטה בשימוש נרחבת של הערכה ברזולוציה. ברגע שהערוץ הראשון הוא משביעת רצון, ליזום רצף שני עבור sequential סריקה. באופן כללי, עדיף לסרוק fluorophore אורך הגל הארוך ראשונה. חזור על שלב 6.1 בערוץ שני. לאשר חוסר החפיפה ספקטרלית על ידי הדמיה פקדים צבעוניים יחיד עם שני רצפי הסריקה. חפיפה ספקטרלית קלה ניתן לתקן באמצעות תכונות ערבוב בלתי רפאים בתוכנה, לעומת זאת יש להימנע במידת האפשר. 7. רכישת תמונה לרכוש תמונות. הדמיה כמותיים, מומלץ להשיג לפחות 20 תמונות / מצב. המספר המדויק, לעומת זאת, צריך להיות מוגדר על פי השאלה הניסיונית בתיאום עם גישה סטטיסטית כגון חישוב גודל מדגם. להציל את הניסוי. 8. Deconvolution פתח קובץ עם תוכנת deconvolution או מעבד אצווה. בדקו פרמטרים לכל ערוץ באמצעות תוכנה. אשר הספקטרום של כל ערוץ עירור ופליטה, פליטת דלדול STED, וdirec ההדמיהtion (למעלה או למטה, אם התמונה היא 3 ממדים) בפרט. Deconvolve באמצעות אשף deconvolution. הגדרות ברירת מחדל הן בדרך כלל נאותות, אולם יחס אות לרעש (SNTR) ישתנה מfluorophore לfluorophore ויצטרך להיקבע עבור כל ערוץ וכל ניסוי בנפרד.

Representative Results

ברור, מטרה העיקרית של הדמיה ברזולוציה הסופר תהיה שיפור לעומת מיקרוסקופיה confocal הקונבנציונלית. יחד עם זאת, יש כמה מכשולים נפוצים שעלולות להוביל להחלטה שאינה אופטימלית. אלה דורשים כי כל ניסוי להיות מותאם באופן אינדיבידואלי. בניסוי הנציג שלנו, אנחנו ההדמיה רשת ה-F-אקטין בתא NK מופעל על ידי הנוגדן מאוגד זכוכית. גורמים שכיחים ל( ותיקונים ל) חוסר ברזולוציה משופרת של STED מעל confocal הם כדלקמן: מתחת לדגימה (איור 1 א). זה עשוי להוביל לגרעיניות ואובדן של מידע פיקסל, כפי שמוצג על ידי רזולוציה נמוכה של סיבי ה-F-אקטין. שורה מוגברת או מיצוע מסגרת לעתים קרובות יכולה לתקן את זה. הלבנת ו / או מעל הדגימה (איור 1b). זו עלולה להיגרם על ידי פיקסל להתעכב זמן ממושך, כתוצאה ממיצוע שורה המוגזמת. לחלופין, הוא עשוי להיות תוצאה של סריקת יתר של התמונה לפני הרכישה, ובכלל זה שימוש יתר שללייזר דלדול. התוצאה היא בדרך כלל בתמונות מעורפלות או מטושטשות. ניתן לתקן זאת על ידי סריקת השדה של ריבית בלבד מינימאלי לפני הרכישה או, אם אפשר, הגדלת מהירות סריקת לייזר. אם הבעיה נמשכת, ניתן לצמצם את כוח לייזר דלדול. על ידי השגת האיזון הנכון של זמן להתעכב פיקסל, כוח לייזר עירור, וכוח לייזר האזילה, תמונה עם רזולוציה משופרת ומידע מספיק יכול להיות שנוצר (איור 1 ג'). רזולוציה ניתן לשפר עוד יותר על ידי השימוש בdeconvolution (1D איור). כאשר הרכישה היא מותאמת, deconvolution תשפר את הרזולוציה הן איכותית וכמותית ותת -100 הרזולוציה ננומטר צריכה להיות באופן שגרתי להשגה. איור 1. אופטימיזציה של רכישה ומלכודות נפוצות של ההדמיה STED. NK92 תאים הופעלו על זכוכית מצופה אנטי CD18 ו- NKp30 עבור 20 דקות לאחר מכן קבועות, permeabilized ומוכתמת עבור ה-F-אקטין עם Phalloidin אלקסה פלואוריד 488.) דוגמא של אובדן של מידע תמונה בשל. ב מתחת לדגימה) דוגמא לאובדן הרזולוציה בשל תנאי הלבנת / ג על הדגימה) ד מותאם) תנאים מותאמים להוביל לשיפור גדול יותר ברזולוציה עם deconvolution. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

Discussion

השיפור ברזולוציה מעל confocal יהיה קצת תלוי בגורמים שלא ניתן לשלוט. גורמים אלה כוללים סטיות קלות בעובי להחליק את מכסה וחוסר עקביות בתקשורת הרכבה. זה חשוב כדי לשמור על הטמפרטורה והלחות בחדר ההדמיה כעקבי ככל האפשר, ואת קרן STED יש realigned בערך כל 60 דקות. כפי שצוין בנהלים, יש להימנע משימוש במדיום Vectashield גובר, שכן זו אינה תואמת לSTED. בנוסף אליו, יש תמיד להשתמש # 1.5 התלושים לכסות, ואם זמין, להשתמש באותם אשר אומתו לעובי מסוים.

שינוי אחד של הגישה שתוארה כאן הוא לערוצים נוספים בתמונה confocal, באמצעות fluorophores שפולט באורך גל ארוך יותר מקורה STED. בדרך זו, תמונה יכול אחד עד ארבעה ערוצים (שני בconfocal, שתיים בSTED). עם זאת, דואר הערוצים עם fluorophores אם לוקח את הגישה הזוmitting מעל לייזר דלדול STED יצטרך להיות צילם ראשון, כיישום של קורה STED יהיה לרוקן פוטונים בערוצים אלה. אחד יתרונות לטכניקה זו הוא היישום של gating הזמן, שגם ישפרו את הרזולוציה בconfocal על ידי ביטול פליטה מפוטונים עם משך חיים קצרים 34. בפרט, השימוש בgating הזמן, העיתוי של גלאי פליטה להתכתב עם עירור פעם STED, יקטן הקרינה רקע מהשתקפות מזכוכית coverslip כאשר הדמיה קרובה אליו. גם בניסוי אינו מתאים לSTED, אם באמצעות מקור עירור פעם, gating הזמן יכול להיות כלי שימושי לשיפור רזולוציה בconfocal.

ישנם שינויים שונים שיכול להיות מנוצל כדי לשפר את הרזולוציה בSTED. אחת הוא להקטין את גודל חריר מיחידת Airy 1 הסטנדרטי, אם כי זה גם יקטין את כמות האור המגיע למדגם. זה יכול להיות פיצוי על ידי הגדלת lasכוח אה או רווח. נוסף הוא להגדיל את ממוצע הקו, אשר יגדיל את כמות המידע שנאספה עבור כל פוטון, שיפור ברזולוציה. שוב, עם זאת, זה עשוי להיות בעלות של photobleaching של המדגם, ולכן איזון צריך להיות פגע בין הרזולוציה ולבנה. באופן דומה, שימוש בחלבוני ניאון כגון GFP ידרשו אופטימיזציה זהירה, כדי למנוע הלבנת. ניתן לעשות זאת על ידי הפחתת כוח לייזר STED במידת צורך. נקודות זמן ארוכות יותר תאפשר גם להתאוששות פוטון גדולה יותר ולצמצם את הלבנת. תיקון לphotobleaching יטופל בעת ניתוח STED חיות.

כמובן, ההדמיה ב 3 ממדים בSTED היא גם אפשרית, וגם תיתן שיפור לעומת confocal הדמיה קונבנציונלית. זה נכון במיוחד אם זה נעשה בשילוב עם deconvolution, אם כי יש לנקוט זהירות כדי לתקן את סחיפה המתרחשת במהלך ההדמיה מטוסים מרובים בציר ה-z. אם אתם משתמשים בתוכנת הויגנסלdeconvolve, תיקון זה מתקבל באמצעות התכונה "לייצב תמונה". שימוש בגישה זו, ברזולוציה בציר ה-z תהיה שיפור. זהו שיפור גדול על פני הדמיה קונבנציונלית confocal, שבו יש רזולוציה צירית עניות, ואפילו על סתם STED עצמו, שיש גם ברזולוציה Z-ציר דל יחסית. בעוד רכישת ערימות מרובות בSTED, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע הלבנת של המדגם, ובמידת צורך ניתן להפחית מיצוע קו או עוצמת כוח לייזר על מנת לעשות זאת. שוב, יש לציין שאם הדמיה fluorophores האחר שאינם מתאימים לSTED, יישום של קורה דלדול בסריקה סדרתית הראשונה ימנע פליטה מערוצים אלה. לכן, גישת STED / confocal מעורב (בעת השימוש בסריקת confocal בערוצים אשר פולטים באורך גל גדול מ592 ננומטר) תהיה למרבה הצער, לא בהכרח מתאימה ל3D.

לסיכום, יש לנו נבחרו STED כגישה בשל קלות היחסית של יישוםlication ושיפור ברזולוציה מעל confocal הדמיה סטנדרטית. הדמיה סינפסה החיסונית, היא הוכיחה טכניקה יעילה ובעל ערך שמאפשרת לנו לראות פרטים בארכיטקטורת ה-F-אקטין לא ניתן ברזולוציה מעל 200 ננומטר. בעוד שרבים מהפרטים האלה נראים עדינים, הם יכולים להיות השפעה עמוקה על תפקוד תא NK. לפיכך, אנו פונים טכנולוגיית ההדמיה הננוסקופי האחרונה להפקת מידע זה הוא קריטי לשמירה על בריאות אדם.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לג'ף דניאלס לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי R01 AI067946 לתזמורת ירושלים

Materials

#1.5 cover slips VWR 48393-172
BD Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554722
Bovine serum albumin Sigma A2153
Cotton tipped applicator Fisher Scientific S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml) VWR 352070
Fetal calf serum (FCS) (500 mL) Atlantic Biologicals S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange Life Technologies P31584
Laboratory tissue wipers VWR 82003-820
Nail polish VWR 100491-940
NK-92 cells ATCC CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488 Life Technologies A12379
Phosphate buffered saline Life Technologies 14190250
Prolong anti-fade reagent Life Technologies P7481
Purified anti-CD18 Biolegend 301202
Purified anti-NKp30 Biolegend 325202
Purified anti-perforin Biolegend 308102
RPMI 1640 medium (500 mL) Life Technologies 11875-093
Saponin from Quillaja bark Sigma S4521
Super PAP pen Life Technologies 008899
Triton X-100 Electron Microscopy Sciences 22142
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
Huygens deconvolution software SVI Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope Leica Microsystems Contact company
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, . Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski, ., Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Tags

Immunological SynapseNatural Killer CellsActin ReorganizationSuper-resolution ImagingStimulated Emission Depletion (STED) NanoscopyTime-gated STEDCytotoxic SynapseF-actin Architecture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy. J. Vis. Exp. (85), e51100, doi:10.3791/51100 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image