使用<em>ハチノスツヅリガ</em>モデル生物として研究する<em>レジオネラ·ニューモフィラ</em>感染症

1。 Lの準備感染のニューモ チャコール酵母エキス（CYE）プレート（2g / Lの活性炭、10g / Lの酵母エキス13 g / Lの寒天、10g / LのN-（2 – アセトアミド）-2 – aminothanesulfonic酸（ACES）を、調製1 g / Lのα-ケトグルタル、0.4グラム/ LのL-システイン塩酸及び0.25グラム/ Lのピロリン酸第二鉄、pHは6.9）。 注：必要に応じて、プレートをCYEする（6μg/ ml）を、カナマイシンを追加（25μg/ mlの）および/またはクロラムフェニコール。 すべてのL.を実施ローカルルールに準拠した微生物安全キャビネット（MSC）でのバイオセーフティ封じ込めレベル2（BSL-2）でのニューモ作品。 ストリークL. CYEプレート上-80℃のグリセロールストックからのニューモ 37℃で4日間プレートをインキュベート注：4日間のプレートのインキュベーションは、大幅にLの病原性を増加Gのニューモ 3日間のインキュベーションの上mellonella。 ある日、感染の前に、1ループFUを再懸濁予め温め1ml中の細菌のllの（いくつかのコロニーを含む）（37℃）酵母エキス（AYE）ブロスをACES及び分光光度計を用いて600nmで（OD 600）での吸光度を測定する。 最終OD 0.1の600に（必要に応じて抗生物質）の新鮮な3ミリリットルのAYE文化を接種する。 メディアはメディアだけの無菌性を確保するための制御が含まれる。 21時間、200rpmで振盪インキュベーター中で37℃で培養する。 注意：細菌は、感染38対数期後に成長しなければならない。 21時間成長させることは実験を標準化することを可能にする。 注：タンパク質誘導に必要な場合には、一晩イソプロピル0.5 mMのβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を追加します。 600（細菌がポスト指数増殖期、OD 600 2.5〜3にする必要があります）外径を測定します。 無菌のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）中で1×10 9 CFU / mlのを与えるために、細菌培養を希釈する。 ノート：以前の結果に基づいて、1のOD 600が 1×10 9 CFU / mlに相当するが、これは、異なるL.のために確認されるべきであるニューモ株 。 注：プラスミドからのタンパク質の誘導が必要な場合は、接種物にIPTGを1 mMのを追加します。 予想されるCFUが接種物中に存在していることを確認するための対照としてセクション9で説明したように接種物プレート。 2。幼虫の調製十分なG.を購入商業的供給者からmellonella幼虫 。幼虫は5 番目か（長さ約2〜3センチメートル間）6 番目の齢の段階で出荷され、すぐに使用に適している。 注意：幼虫は、以前に39記載されているか、リア記述する方法を。 注：幼虫は2週間まで室温で保存することができ、食品を必要としない。すぐに蛹化の兆しを見せて任意の幼虫を捨てる。 PLACで幼虫のための容器を準備します10センチメートルペトリ皿の底に10cmの濾紙の輪をING。 無愛想な先端ピンセットを使用して、ペトリ皿にほぼ同様の大きさの10の健康な幼虫を置く。 注：不健康な茶色やしみを見昆虫を廃棄します。健康な幼虫を均一にクリーミーな暗い色落ちのない分野で着色し、裏返した場合にすぐに自分を正しくすることができますされています。 3。 Gの感染mellonella幼虫 表面に、濾紙の輪をテーピングによる注射プラットフォームを準備します。 安全に注射プラットフォームを作成するために、ろ紙に水平P1000チップをテープで固定します。これは、無菌である必要はない。 70％エタノールを吸引し、少なくとも10分間インキュベートすることによって20μlのマイクロシリンジを殺菌する。 注入しながらパンク証拠手袋を着用し、 数回吸引し、滅菌水を排出することにより、任意の残留エタノールを除去します。 USI注射器、吸引L.10μlのngのニューモ 1×10 9 CFU / mlのサスペンション。 P1000チップの上に曲げ、1幼虫を取り、慎重に、しっかりと再びオンにします。 幼虫の正面、右腹脚にわたって注射器の先端を置きます。 優しく、それは幼虫の中にあることを確認しながら、腹脚に針の先端を挿入し、スムーズにシリンジの内容のすべてを注入します。 注：注射器が正しく挿入されている場合は、チャンバー内にそれを配置するだけで、注射器を使って幼虫をピックアップすることが可能なはずである。 注射後、数秒間の幼虫を観察します。幼虫は数秒後にクロールを開始しますが、流体を排出しないでください。 10 7 CFU L.による感染;簡潔には数時間感染後の幼虫を観察するニューモ 130b は最初の5-8時間のPI内の任意の症状が発生することはありませんので幼虫は黒/グレーのこのポイントの前に、T回っている場合は、彼は実験を中止すること。 注意：1 mMのIPTGで幼虫の接種は、実験の過程で、幼虫の生存率には影響しません。 同様にして、幼虫の死亡率を分析するための対照として機能するD-PBSを注射した10幼虫を含む条件あたり10幼虫の合計を注入する。 テープペトリ皿を閉じ、二次格納容器内の場所。 実験期間中、37℃で標準的な細菌培養器で培養する。 4。化学阻害剤と幼虫の前処理セクション3.1から3.6で説明したように、感染前に、注射のために幼虫を準備します。 前にサイトカラシンDの100μMの溶液10μlを注入、10幼虫の腹脚を残しました。 注：阻害剤を、幼虫への損傷を低減するために、細菌懸濁液異なる腹脚に注入される。 対照として、10幼虫へのDMSO 10μLを注入。 で幼虫をインキュベート4時間37℃に。 フロントにセクション3で説明したように、WT Lの1×10 7 CFUのいずれかで右腹脚前処理幼虫を注入ニューモまたはPBS対照。 5。幼虫の死亡率の分析 18時間後の感染（PI）で、死亡率のためのすべての感染した幼虫を調べる。 死亡率を確認するには、幼虫を裏返し、足の動きを探すために鈍な先端ピンセットを使用し、健康的な幼虫はすぐに彼ら自身を正しくする必要があります。色素沈着は、感染に対する強い免疫反応を示している。どんな動きがある場合は、として生きて数える。 死者と生きている幼虫のレコード番号。 選択した他のすべての時点で、このプロセスを繰り返します。 注意：インキュベーションは、3日以上継続すると、蛹を見ることができる。任意の蛹を取り外し、で凍結安楽死させる – 20℃の変態が発生する前に。 6。血リンパの抽出ランダムに選択して3このような5および18時間のPIとして選択された時点で14ミリリットルチューブに幼虫と場所、 幼虫の脚部の移動が見られなくなるまで、5〜10分間氷上で、このチューブを配置します。 ペトリ皿に、麻酔した幼虫を置き、、メスを用いて、幼虫の尾の近くに2つのセグメント間の切開を行います。 体液を収集するために1.5mlの滅菌遠心管に幼虫を絞る。 少なくとも3個体由来のプール血リンパ。一つの幼虫はサイズに応じて血リンパの15〜50μlの間で提供します。 注：血リンパ抽出中には、サンプルの汚染の可能性をもたらし、腸を破壊する非常に簡単です。細菌をプレーティングしかし、抗生物質の選択は、常に必要となります（離れて腸からの）尾部の近くに幼虫を切断することにより汚染を減少させる。 茶色と凝固を回すから体液を防ぐために、プロセスの収集後10分以内に血リンパ：注意してください。 死んだ幼虫を確保するために、20℃で一晩 – で新しい14ミリリットルファルコンチューブ、シール、所定の位置に幼虫の体を捨てる。 死んだ幼虫をオートクレーブローカルルールに従って廃棄してください。 7。血球生存率の決定上記のような体液を抽出します。 0.02％の20μlの96ウェルプレートの1ウェル中のPBS中（V / V）トリパンブルーを用いて抽出血リンパ液20μlを混ぜる。 室温で5分間インキュベートする。 血球計数器にロード血リンパ液10μlをし、（青ではない）生細胞を数える。 誤差を小さくするために三重に各サンプルを数える。 8。免疫蛍光顕微鏡用に抽出血球処理 24ウェルプレート10〜15ミリメートルのガラスカバースリップ上に少なくとも3幼虫やピペットから抽出されたプールされた体液を混ぜる。 注意：血球、ガラスに付着することができるようにカバーガラスは、治療を必要としません。 D-0.5mlのを追加します。PBSおよび上下にピペットでよく混和すること。 エアロゾル気密遠心プレートホルダーを用いて室温（RT）で500×gで10分間プレートを遠心分離する。 血球が付着していることを確認するために倒立顕微鏡を用いて各ウェルを調べます。 上清を除去し、慎重にプレート2〜3倍の揺れやピペットでD-PBSを除去し、ウェルの壁に0.5ミリリットルのD-PBSを加えることによって、細胞を3回洗浄する。 PBS中の4％（v / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）0.5mlを添加することによって細胞を固定。 室温で20〜30分の間に細胞を培養する。 以前のように、D-PBSで細胞を3回洗浄する。 0.5ミリリットルの15mMのNH 4 Clが残留PFAを急冷し、室温で15分間インキュベートし、PBS中に追加します。 D-PBSで細胞を3回洗浄する。 注：この段階では、カバーガラスを4℃で一晩保存することができる PBS中の0.5 mlの0.1％トリトンX-100を添加し、細胞を透過するようにRTで5分間インキュベートする。 </li> 溶液（2％（PBS中w / v）のBSA）で1時間ブロッキングするためのブロック。 メーカー指定の希釈でブロッキング溶液で希釈した一次抗体と暗闇の中で、室温で1時間インキュベートする。 PBSで3回洗浄します。 上記のような細菌の可視化のための二次抗体およびDAPIで1時間インキュベートする。 PBSで3回洗浄します。 スライドガラス上にマウント試薬の1滴を使用してカバースリップをマウントします。 完全にマウントソリューションを乾燥させるために、室温で暗所で一晩インキュベートする。 画像は、蛍光顕微鏡上を摺動する。 9。細菌CFUの定量化腸内細菌叢による汚染を避けるために、プレートをCYE 100μg/ mlのスペクチノを追加します。L.ニューモ株 130bは40をスペクチノは当然抵抗力がある。 血リンパの抽出の前に、1.5ミリリットル遠心管の重量を量る。 セクション6で説明したように血リンパを抽出し、秤量トンに置くubes、5 mg / mlのジギトニンの1μLを加え、よく混ぜると血球を溶解し、室温で5分間インキュベートする。 血リンパでチューブを再秤量し、抽出された体液の重量を決定する。 無菌AYE培地で血リンパの10倍連続希釈を行う。 ペンを使用して、6等しいセクターやラベルにCYEプレートのベースを分割します。 プレートの各セクションにあるプレートの各希釈液25μlを3滴（最も希薄で始まる）。 37℃で一晩最大限のふたで培養する滴が十分に乾燥したら、上のプレートを回すと、少なくともさらに2日間、37℃でインキュベートする。 各希釈でコロニーを計数することにより抽出された細菌を定量化し、抽出された体液の量に正規化する。 10。競争指数（CI）の決定両株のブロス培養中とCYE寒天プレートPRIOにも同様に成長していることを確認競争力のあるインデックスを試みるR。 セクション1で説明したように、WTまたはカナマイシン耐性変異細菌懸濁液を調製し、1:1の割合で混ぜます。 CYEスペクチノへの接種物（100μg/ ml）をし、CYEスペクチノ/カナマイシンプレート段階希釈幼虫に感染し、上記のように適当な時点で体液を抽出する。 血リンパを抽出し、CYEスペクチノとCYEスペクチノ/カナマイシン上に段階希釈をメッキすることにより生菌数を決定します。 CI =（変異出力/ WT出力）/（変異接種材料/ WT接種）を次のように競争力指数（CI）を計算します。