JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

استخدام<em> غاليريا mellonella</em> كما كائن نموذج لدراسة<em> البكتيريا المستروحة</em> عدوى

Published: November 22, 2013
doi:
10.3791/50964
, , ,
1Center for Molecular Bacteriology and Infection,Imperial College London

Summary

تأسست مؤخرا يرقة عثة الشمع من غاليريا mellonella باعتبارها في الجسم الحي نموذج لدراسة العدوى المستروحة البكتيريا. هنا، علينا أن نظهر التقنيات الأساسية لتوصيف المرضية من البكتيريا في اليرقات، بما في ذلك التلقيح، وقياس الفوعة البكتيرية والتكرار وكذلك استخراج وتحليل hemocytes المصابة.

Abstract

الليجيونيلا المستروحة، العامل المسبب لالتهاب رئوي حاد يدعى مرض المحاربين "، هو الممرض الذي يصيب الإنسان مهما ويعيد داخل الضامة السنخية. الفوعة، يتوقف على نظام نقطة / آي سي إم إفراز النوع الرابع (T4SS)، وهو أمر ضروري لإنشاء فجوة متساهلة تكرار المعروفة باسم البكتيريا التي تحتوي على فجوة (LCV). L. يمكن أن تكون على غرار العدوى المستروحة في الفئران ولكن معظم سلالات الفئران ليست متساهلة، مما أدى إلى البحث عن نماذج العدوى الرواية. أظهرنا مؤخرا أن يرقات عثة الشمع من غاليريا mellonella هي مناسبة للتحقيق في L. عدوى المستروحة. G. يستخدم mellonella متزايد لتكون نموذجا للعدوى مسببات الأمراض البشرية وجود علاقة جيدة بين الفوعة العديد من الأنواع البكتيرية في الحشرات والثدييات في النماذج. ومن المكونات الرئيسية من الدفاعات المناعية اليرقات هي hemocytes، والمهنةالبالعات القاعدة الذي يستغرق وتدمير الغزاة. L. المستروحة قادرة على إصابة، تشكيل LCV وتكرار داخل هذه الخلايا. نحن هنا لشرح البروتوكولات لتحليل L. الفوعة المستروحة في G. نموذج mellonella، بما في ذلك كيفية زراعة المعدية L. المستروحة، يمهد للمعالجة اليرقات مع مثبطات، تصيب اليرقات وكيفية استخراج الخلايا المصابة لتقدير والمناعي المجهري. نحن أيضا تصف كيفية قياس تكرار البكتيرية واللياقة البدنية في المقايسات المنافسة. هذه الأساليب تسمح للفحص السريع للالمسوخ لتحديد العوامل الهامة في L. الفوعة المستروحة، واصفا أداة جديدة لمساعدة فهمنا لهذا الممرض المعقدة.

Introduction

وقد أثبتت النماذج الحيوانية للعدوى لا تقدر بثمن في تحديد عوامل الفوعة البكتيرية. ومع ذلك، فقد اكتسبت نماذج اللافقارية اهتماما متزايدا كبديل عملي لنماذج الثدييات التقليدية للعدوى. يرقات عثة الشمع، يتزايد استخدام غاليريا mellonella لدراسة عدد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، بما في ذلك إيجابية الجرام 1 والبكتيريا سالبة الجرام 2،3 والعديد من الفطريات المسببة للأمراض 4،5. باستخدام نموذج الحشرات لديها عدد من المزايا على نماذج الثدييات التقليدية، باعتبارها اللافقارية، G. mellonella لا تخضع لقيود أخلاقية من نماذج الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، اليرقات يمكن الحفاظ بسهولة، المصابين عن طريق الحقن بدون تخدير، والخضوع المعالجة مع مثبطات الكيميائية 6 والحفاظ الحضانة عند 37 درجة مئوية 7. ومن المثير للاهتمام، وجود علاقة جيدة بين تسببها العديد من الكائنات الحية الدقيقة في G. ميلوقد أنشئت lonella ونماذج الثدييات العدوى 2،8. زيادة فهم نظام المناعة من G. mellonella ساعدت أيضا في توصيف هذا النموذج الحي. على الرغم من أن الحشرات لم يكن لديك جهاز المناعة التكيفية كما وجدت في الثدييات، لديهم الدفاعات الخلوية وعضدي متطورة بما في ذلك إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات 9. Hemocytes هي الوسيط الرئيسي للدفاعات الخلوية وهم الأكثر عددا نوع من الخلايا الموجودة في الدملمف (أو الدم) من G. mellonella 10، هذه الخلايا هي البالعات المهنية وتؤدي وظائف مشابهة لالضامة الإنسان والعدلات من قبل كل من تناول والمهينة البكتيريا في البلعمة؛ الأكل-الليزوزومية مقصورة 10،11 وتشكيل عقيدات حول غزو البكتيريا، وتقييد النسخ المتماثل جسديا البكتيرية 12.

الليجيونيلا المستروحة هو الممرض في الجهاز التنفسي التي تسبب pneumoni شديدةو(مرض الفيالقة) في فئات سكانية حساسة مثل كبار السن أو ضعف المناعة 13. تم العثور على البكتيريا بتواجد مطلق في مصادر المياه من الناحيتين البيئية والتي من صنع الإنسان، حيث هو الممرض الأنواع المختلفة من المياه العذبة الأميبات 14،15. يبقى البكتيريا و يعيد ضمن هذه البالعات المهنية من خلال الاستفادة من مجمع متعدد البروتين المعروف باسم نقطة / آي سي إم (خلل في الاتجار عضية / تكاثر الخلايا) اكتب 4 نظام إفراز (T4SS) لنقل من أكثر من 275 البروتينات المستجيب في الخلية المضيفة 16-20. هذه البروتينات تعمل على تخريب طبيعية مسارات أكلة الخلية المضيفة، مما أدى إلى خلق فجوة تحتوي على البكتيريا (LCV). وLCV يتجنب الانصهار مع الجسيمات الحالة وتجند الشبكة الإندوبلازمية بدلا من ذلك (ER) الحويصلات المشتقة، مما أدى إلى حجرة المتخصصة التي تمثل ER الخام 21،22. L. يعتبر المستروحة مسار عرضي الإنسانogen، ونفس الاستراتيجيات التي تسمح لها لتكرار داخل الأميبات، كما تسمح تكرارها في الضامة السنخية الإنسان 23.

وقد اتسمت المضيفين الثدييات كنماذج لعدوى البكتيريا الإنسان بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية 24،25. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من سلالات الفئران المقاومة للعدوى البكتيريا 26 مع استثناء من الفطرية البيضاء A / J الماوس، الذي يتطور، والعدوى ومحدودة ذاتيا خفيفة 24. على الرغم من أن نموذج خنزير غينيا أكثر شبها المرض الإنسان 25، وعدم وجود طفرات وزيادة تكلفة يشجع استخدامها 27. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير عدة نماذج اللافقارية للعدوى البكتيريا المستروحة بما في ذلك انواع معينة ايليجانس 28، الدروسوفيلاميلانوجاستر 29 وعدة أنواع من الأميبات 30-32. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها نقاط ضعف، الفوعة في C. ايليجانس </em> النظام ليس نقطة / آي سي إم تعتمد 28، مما يحد من فائدة هذا الطراز. وقد أثبت نموذج ذبابة الفاكهة فعالة في التحقيق في عوامل الفوعة البكتيرية 29 ويبدو أن واعدة ولكن هذا النموذج لم تتميز بشكل كامل. الأميبات الخلية واحد من المضيفين البيئية للL. المستروحة وتعتبر مثالية للتحقيق في عمل عوامل الفوعة على المستوى الجزيئي 33 ومع ذلك فهناك العديد من الوسطاء هامة للاستجابة الخلية المضيفة للإصابة الثدييات مثل caspases 34. نقاط الضعف في النماذج القائمة، جنبا إلى جنب مع ارتفاع تكلفة والشواغل الأخلاقية المتصلة التجريب الثدييات، أدى إلى البحث عن غيرها من الكائنات النموذج المناسب 29،35.

لقد أثبتنا مؤخرا أن G. mellonella هو نموذج مناسب لL. المستروحة المرضية 36،37. هذا البروتوكول تفاصيل التقنيات التجريبية المستخدمة لتصيبG. جي mellonella اليرقات، وتحليل الأخلاق اليرقات، واستخراج hemocytes عن العد والمناعي وتحديد التكرار من قبل قابلة للحياة كفو يهم من اليرقات المصابة.

Protocol

1. إعداد L. المستروحة للعدوى إعداد الفحم خلاصة الخميرة (CYE) لوحات (الفحم 2 ز / L تفعيلها، 10 جرام / لتر خلاصة الخميرة، و 13 غرام / لتر أجار، 10 جرام / لتر N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic حمض (آسيس)، 1 ز / L α-كيتوغلوتارات، 0.4 جم / L-L السيستين حمض الهيدروكلوريك و 0.25 غرام / لتر بيروفوسفات الحديديك، ودرجة الحموضة 6.9). ملاحظة: إذا لزم الأمر، إضافة الكانامايسين (25 ميكروغرام / مل) و / أو الكلورامفينيكول (6 ميكروغرام / مل) لوحات CYE. تنفيذ جميع L. العمل المستروحة على مستوى الاحتواء السلامة الأحيائية 2 (BSL-2) في خزانة السلامة الميكروبية (MSC) في الامتثال للقواعد المحلية. خط L. المستروحة من -80 ° C الأسهم الجلسرين على لوحات CYE احتضان لوحات لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية. ملاحظة: الحضانة من لوحات لمدة 4 أيام إلى زيادة كبيرة في ضراوة L. المستروحة في G. mellonella أكثر من الحضانة لمدة 3 أيام. قبل يوم واحد العدوى، في resuspend واحدة حلقة فوليرة لبنانية من البكتيريا (التي تحتوي على العديد من المستعمرات) في 1 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) ACES خلاصة الخميرة (آي) مرق وقياس الامتصاصية في 600 نانومتر (OD 600) باستخدام مقياس الطيف. تطعيم ثقافة مل 3 AYE جديدة (مع المضادات الحيوية إذا لزم الأمر) إلى OD 600 من 0.1 النهائي. وتشمل وسائل الإعلام لضمان السيطرة إلا العقم وسائل الإعلام. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 21 ساعة. ملاحظة: يجب أن تزرع البكتيريا إلى مرحلة ما بعد الأسي ل العدوى 38. المتزايد على 21 ساعة يسمح التجارب لتكون موحدة. ملاحظة: إذا كان ذلك مطلوبا للبروتين الاستقراء، إضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) بين عشية وضحاها. قياس OD (يجب أن تكون البكتيريا في مرحلة النمو بعد الأسي، OD 600 2.5-3) 600. تمييع ثقافة البكتيرية لإعطاء 1 × 10 9 كفو / مل في الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة Dulbecco و(D-PBS). مذكرة: بناء على النتائج السابقة، وهو OD 600 من 1 يتوافق مع 1 × 10 9 كفو / مل، ولكن هذا يجب أن يتم تأكيده لمختلف L. سلالات المستروحة. ملاحظة: إذا كان مطلوبا تحريض على البروتين من البلازميد، إضافة 1 ملم من IPTG إلى اللقاح. لوحة اللقاح كما هو موضح في القسم 9 كعنصر تحكم لضمان المتوقع كفو موجود في اللقاح. 2. إعداد يرقات شراء ما يكفي من G. mellonella اليرقات من مورد التجارية. يتم شحن اليرقات في المرحلة ال 5 أو ال 6 الطور (تقريبا بين 2-3 سم في الطول) وتكون مناسبة للاستخدام على الفور. ملاحظة: هناك طريقة تصف كيفية الخلفية وقد وصفت اليرقات سابقا 39. ملاحظة: يرقات يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين ولا تتطلب الغذاء. تجاهل فورا عن أي اليرقات تظهر عليها علامات التشرنق. إعداد الحاوية لليرقة التي كتبها PLACجي دائرة من 10 سم ورقة تصفية في الجزء السفلي من طبق بتري 10 سم. باستخدام الملقط حادة الرؤوس، ووضع عشرة اليرقات صحية مشابهة من حيث الحجم تقريبا في طبق بتري. ملاحظة: تخلصي من الحشرات بني اللون أو بقع أبحث غير صحية. يتم تلوين اليرقات صحي موحد دسم مع عدم وجود مناطق داكنة اللون وقادرون على تصحيح نفسها بسرعة إذا سلمت. 3. إصابة G. mellonella يرقات إعداد منصة حقن عن طريق تسجيل حلقة من ورق الترشيح إلى السطح. الشريط بشكل آمن تلميح P1000 أفقيا إلى ورقة الترشيح لإنشاء منصة الحقن. هذا لا تحتاج إلى أن تكون معقمة. تعقيم 20 ميكرولتر حقنة عيار مكروي بواسطة الشفط الايثانول 70٪ واحتضان لمدة 10 دقيقة على الأقل. ارتداء قفازات واقية أثناء ثقب الحقن، إزالة أي الإيثانول المتبقية عن طريق الشفط وطرد الماء المعقم عدة مرات. باليودنانوغرام الحقنة، نضح 10 ميكرولتر من L. المستروحة 1 × 10 9 تعليق كفو / مل. اتخاذ يرقة واحدة وبلطف ولكن بحزم تحويله على ظهرها، انحنى غيض P1000. وضع غيض من حقنة على الجبهة، proleg الأيمن من اليرقات. بلطف، وإدراج غيض من الإبرة في proleg، والتأكد من أنه داخل اليرقات، وسلاسة حقن كل محتويات حقنة. ملاحظة: إذا تم إدخال حقنة بشكل صحيح، يجب أن يكون من الممكن التقاط اليرقات فقط باستخدام حقنة لوضعه في الغرفة. بعد الحقن، ومراقبة اليرقات لبضع ثوان. وسوف تبدأ اليرقات على الزحف بعد بضع ثوان ولكن لا ينبغي أن تفرز السوائل. مراقبة لفترة وجيزة اليرقات بضع ساعات إصابة آخر؛ الإصابة بفيروس 10 7 كفو L. المستروحة 130B لا يسبب أي أعراض خلال أول 5-8 ساعة بي ذلك إذا اليرقات يتحولون رمادي / أسود قبل هذه النقطة، روقال انه ينبغي وقف التجربة. ملاحظة: التلقيح اليرقات مع 1 ملي IPTG لا يؤثر بقاء اليرقات على مدار التجربة. بنفس الطريقة، وضخ ما مجموعه 10 يرقات لكل حالة بما في ذلك 10 يرقات حقن D-PBS لتكون بمثابة سيطرة على تحليل وفيات اليرقات. الشريط أطباق بتري ومكان مغلق في الاحتواء الثانوي. احتضان في حاضنة البكتيرية القياسية عند 37 درجة مئوية، لمدة التجربة. 4. المعالجة من اليرقات مع المانع الكيميائية قبل الإصابة، وإعداد اليرقات للحقن كما هو موضح في القسم 3،1-3،6. ضخ 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر حل مثبط حركة الخلايا D في الجبهة، ترك proleg من 10 اليرقات. ملاحظة: يتم حقن المانع في proleg مختلفة من تعليق البكتيرية للحد من إصابة اليرقات. ضخ 10 ميكرولتر من DMSO في 10 يرقات كمجموعة تحكم. احتضان يرقات في37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. حقن يرقات سابقة التجهيز كما هو موضح في قسم 3 في الجبهة، proleg الحق إما مع 1 × 10 7 كفو من WT L. المستروحة أو عنصر تحكم برنامج تلفزيوني. 5. تحليل الوفيات اليرقات في 18 عدوى آخر ساعة (بي)، ودراسة جميع اليرقات المصابة عن وفيات. للتحقق من وفيات، واستخدام ملاقط يميل حادة لتسليم اليرقات والبحث عن حركة الساقين، وينبغي أن اليرقات صحية صحيحا أنفسهم بسرعة. تصبغ يشير إلى وجود تفاعل مناعي قوي للإصابة. إذا كان هناك أي حركة، عد على قيد الحياة. عدد قياسي من القتلى واليرقات على قيد الحياة. تكرار هذه العملية في كل نقطة زمنية أخرى المختار. ملاحظة: إذا تم اصلت الحضانة لأكثر من ثلاثة أيام، يمكن أن ينظر إليها الشرانق. إزالة أي الشرانق والموت ببطء من خلال تجميد في – 20 درجة مئوية قبل أن يحدث التحول. 6. استخراج الدملمف عشوائيا اختيار ثلاثةاليرقات ووضع في أنبوب 14 مل في نقاط زمنية مختارة مثل 5 و 18 ساعة بي، وضع هذا الأنبوب على الجليد لمدة 5-10 دقيقة، حتى يمكن ملاحظة أي حركة الساقين من اليرقات. وضع اليرقات تخدير على طبق بتري و، وذلك باستخدام مشرط، وجعل شق بين جزأين بالقرب من الذيل من اليرقات. ضغط على اليرقات في العقيمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي لجمع الدملمف. تجمع الدملمف من ثلاثة أشخاص على الأقل. واحد يعطي اليرقات بين 15-50 ميكرولتر من الدملمف اعتمادا على الحجم. ملاحظة: أثناء استخراج الدملمف فمن السهل جدا لعرقلة الأمعاء، مما يؤدي إلى التلوث المحتمل من العينات. خفض التلوث عن طريق خفض اليرقات بالقرب من الذيل (بعيدا عن القناة الهضمية) ومع ذلك، سوف تكون هناك حاجة دائما اختيار المضادات الحيوية عندما الطلاء خارج البكتيريا. ملاحظة: لمنع الدملمف من تحول البني والتخثر، وعملية الدملمف في غضون 10 دقيقة بعد جمع. تجاهل الجسم اليرقات إلى 14 مل أنبوب جديد الصقر، وختم المكان في – 20 درجة مئوية خلال الليل لضمان اليرقات قد لقوا حتفهم. الأوتوكلاف اليرقات الميتة والتخلص منها وفقا للقواعد المحلية. 7. تحديد الجدوى كرية دموية استخراج الدملمف كما هو موضح أعلاه. مزيج 20 ميكرولتر من الدملمف المستخرجة مع 20 ميكرولتر من 0.02٪ (V / V) الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا. احتضان لمدة 5 دقائق على RT. تحميل 10 ميكرولتر من الدملمف على عدادة الكريات والاعتماد (وليس الأزرق) خلايا قابلة للحياة. عد كل عينة في ثلاث نسخ للحد من الخطأ. 8. تجهيز المستخرجة Hemocytes للالمناعي المجهر مزيج الدملمف المجمعة المستخرجة من ثلاثة على الأقل من اليرقات وماصة على كوب 10-15 ملم ساترة في 24 لوحة جيدا. ملاحظة: Coverslips لا تتطلب العلاج كما hemocytes يمكن أن تنضم إلى الزجاج. إضافة 0.5 مل من D-برنامج تلفزيوني ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 10 دقيقة في 500 XG في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام لوحة أجهزة الطرد المركزي حامل الهباء الجوي ضيق. فحص كل جيدا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن hemocytes انضمت. إزالة طاف وبعناية غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 0.5 مل مد برنامج تلفزيوني على جدار البئر، هزاز لوحة 2-3x وإزالة مد برنامج تلفزيوني مع ماصة. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من 4٪ (V / V) بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا لمدة تتراوح بين 20-30 دقيقة في RT. غسل الخلايا ثلاث مرات مع مد برنامج تلفزيوني، كما كان من قبل. إضافة 0.5 مل 15 ملي NH 4 الكلورين في برنامج تلفزيوني لإرواء المتبقية PFA واحتضان على RT لمدة 15 دقيقة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع مد برنامج تلفزيوني. ملاحظة: في هذه المرحلة، لل coverslips يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إضافة 0.5 مل 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق على RT لpermeabilize الخلايا. </li> كتلة لمدة 1 ساعة مع عرقلة الحل (2٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني BSA). احتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل في التخفيف المحددة من قبل الشركة المصنعة. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية ودابي لتصور من البكتيريا على النحو الوارد أعلاه. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني. جبل لل coverslips باستخدام قطرة واحدة من تصاعد كاشف على الشرائح الزجاجية. احتضان بين عشية وضحاها في الظلام في RT لتجف تماما الحل في تصاعد مستمر. الشرائح الصورة على المجهر مضان. 9. الكمي من البكتيريا كفو إضافة 100 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين لوحات CYE لتجنب التلوث من قبل النباتات الأمعاء. L. سلالة المستروحة 130B هو مقاومة طبيعية للسبكتينوميسين 40. قبل استخراج الدملمف، تزن 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. استخراج الدملمف كما هو موضح في القسم 6 ووضع في وزنه طنubes، إضافة 1 ميكرولتر من 5 ملغ / مل ديجيتونين، تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT لليز hemocytes. Reweigh الأنبوب مع الدملمف وتحديد وزن الدملمف المستخرج. تنفيذ عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل من الدملمف في وسائل الإعلام AYE العقيمة. باستخدام قلم، تقسيم قاعدة لوحة CYE في ستة قطاعات متساوية والتسمية. لوحة ثلاث قطرات من 25 ميكرولتر من كل تخفيف (بدءا من معظم تمييع) في كل قسم من لوحة. احتضان لوحات مع الأغطية أقصى درجات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. مرة واحدة جفت قطرات بالكامل، وتحويل لوحة على واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا يقل عن يومين آخر. تحديد البكتيريا المستخرجة عن طريق عد المستعمرات في كل تمييع وتطبيع لوزن الدملمف المستخرج. 10. تقرير مؤشر تنافسية (CI) تؤكد أن كلا من سلالات تنمو بشكل جيد على قدم المساواة في ثقافة مرق وعلى لوحات أجار CYE PRIOr لمحاولة مؤشر تنافسية. إعداد تعليق البكتيرية متحولة مقاومة WT أو الكاناميسين كما هو موضح في القسم 1 وخلط في نسبة 1:1. لوحة التخفيفات التسلسلي للاللقاح على CYE سبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) وCYE سبكتينوميسين / الكاناميسين تصيب اليرقات واستخراج الدملمف في نقاط زمنية مناسبة كما هو موضح أعلاه. تحديد عدد قابلة للحياة عن طريق استخراج الدملمف والطلاء التخفيفات المسلسل على سبكتينوميسين CYE وCYE سبكتينوميسين / الكانامايسين. حساب مؤشر التنافسية (CI) على النحو التالي: CI = (الناتج متحولة / WT الإخراج) / (اللقاح متحولة / WT اللقاح).

Representative Results

هنا يتجلى أن G. mellonella هو النموذج المناسب، وسهلة الاستخدام لدراسة L. عدوى المستروحة. سابقا وقد تبين أن L. الفوعة المستروحة في الضامة، ونماذج الأميبات الثدييات يعتمد على وجود نظام إفراز دوت / آي سي إم 41-43. G. أصيب mellonella يرقات كما هو موضح أعلاه والفوعة من نوع البرية (WT) وسلالة دوت / آي سي إم التي تعاني من نقص مقارنة. العدوى مع 10 7 كفو من L. أسفرت سلالة المستروحة 130B في وفيات 100٪ في غضون 24 ساعة بعد العدوى (بي). ومع ذلك، فإن L. المستروحة Δ DOTA السلالة، التي ليس لديها نظام إفراز دوت / آي سي إم T4SS وظيفية، وكان عديم الفوعة في هذا الاختبار (الشكل 1). هذا يدل على أن L. الفوعة في المستروحة G. mellonella يعتمد على إزفاء من المستجيبات دوت / آي سي إم، مما يجعل هذا النموذج مناسبة لتوصيفوظيفة هذه البروتينات. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن تثبيط البلعمة بواسطة العلاج مثبط حركة الخلايا زاد susceptibly من اليرقات للعدوى الخميرة المبيضات البيض 6. كما L. المستروحة هو الممرض داخل الخلايا، فقد تقرر تحديد ما إذا كان الإقبال على البكتيريا هو أمر حاسم في التسبب في هذا النموذج. كانت سابقة التجهيز اليرقات مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D (التنمية الشبابية المجتمعية) لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية، ثم المصابين 10 7 كفو من WT L. لم 130B المستروحة وفيات رصدها على مدار 24 ساعة العلاج بي مع المانع وحدها لا تؤثر على بقاء اليرقات. ومع ذلك، سابقة التجهيز، اليرقات المصابة عرض أكبر بكثير البقاء على قيد الحياة (P = 0.0066، المفردة T-اختبار) مقارنة مع المعالجة DMSO والحشرات المصابة (الشكل 2). تم إلغاء تأثير العلاج التنمية الشبابية المجتمعية بنسبة 48 بي ساعة (النتائج غير معروضة)، وهذا قد يكون راجعا إلى نصف عمر الدواء في G.mellonella. هذا يدل على أن الإقبال على L. المستروحة إلى G. mellonella hemocytes هو جانب هام من الفوعة الجرثومية. من أجل التحقق من صحة التعبير وتحديد توطين التحت خلوية من البروتين المستجيب في G. mellonella، تم استخراج hemocytes ومعالجتها لالمناعي المجهري. أصيب اليرقات مع WT وΔ DOTA L. المستروحة 130B تعبر عن جزء من المستجيب T4SS محددة جيدا، صدق 41-918، تنصهر إلى 4 علامات HA N-محطة. وقد تجلى هذا المستجيب لربط LCV عبر مجال ملزمة فسفوإينوزيتيد-4-44-الفوسفات. استخدام الألغام المضادة للHA (الحمراء)، ومكافحة البكتيريا (الأخضر) الأجسام المضادة، 4HA-صدق 41-918 مترجمة إلى LCV في hemocytes المصابة (الشكل 3). وقد سبق عرض هذا التعريب في discoideum الأميبات Dictyostelium والضامة في الثدييات 44،45 تؤكد جomparability من هذا الطراز. عادة ما يتم تحديد أهمية البروتينات لالفوعة بمقارنة حركية النمو من النوع البري والبكتيريا متحولة. من أجل متابعة حركية تكرار البكتيرية على مدى الإصابة، تم التضحية ثلاثة اليرقات في كل نقطة زمنية (0، 5، 18، و 24 ساعة بي)، الدملمف جمع وتجميع وCFU/0.1g من الدملمف المستخرج يحدد فيما بعد. بعد تراجع الأولي في 5 ساعة بي، وكفو من البكتيريا WT زيادات تصل إلى 24 ساعة بي ومع ذلك، فإن سلالة Δ DOTA لا يقع تحت تكرارها ويتم مسح في 18 ساعة بي (الشكل 4). قدرة L. منذ فترة طويلة وثقت المستروحة أن يسبب تحلل الضامة في الطريقة التي تعتمد على T4SS 46، ومع ذلك تم إجراء أي دراسات مشابهة في الجسم الحي. تم تحديد تركيز hemocytes المتداولة بنسبة 5، 18، و 24 ساعة بي أصيبوا اليرقات مع WT أو Δ <eم> DOTA L. المستروحة 130B، hemocytes المستخرجة من الحشرات المصابة خلايا قابلة للحياة وعدها باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق. في 5 ساعة بي يمكن أن ينظر لا فرق في التهم كرية دموية بين سلالات (الشكل 5). ومع ذلك، في 18 ساعة بي كان هناك انخفاض كبير في تركيز كرية دموية في WT، ولكن ليس Δ DOTA، اليرقات المصابة. هذا الفرق لا تزال قائمة في 24 ساعة بي الانخفاض في عدد كرية دموية، جنبا إلى جنب مع وجود البكتيريا داخل الخلايا كما يراها المناعي، يوحي بأن L. المستروحة يعيد داخل hemocytes ثم lyses لهم، مما يسمح للبكتيريا للخضوع لعدة جولات من النسخ المتماثل. الشكل 1. الإصابة L. المستروحة يدفع دوت / آي سي إم التي تعتمد على وفيات اليرقات. أصيب 10 يرقات مع برنامج تلفزيوني وحدها أو 10 <sتصل> 7 كفو من النوع البري (WT) أو Δ DOTA L. المستروحة 130B، حضنت في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ووقت وفاة سجلت اليرقات. جميع اليرقات المصابة مع WT يستسلم للإصابة خلال 24 ساعة آخر العدوى (بي)، ولكن كان ينظر أي وفيات في اليرقات تلقيح مع برنامج تلفزيوني وحدها أو سلالة Δ DOTA. النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة، ​​± الانحراف المعياري. الشكل 2. وفيات تعتمد على استيعاب البكتيرية. L. 10 كانت سابقة التجهيز المستروحة اليرقات مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D (التنمية الشبابية المجتمعية) لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم المصابين 10 7 WT وفيات رصدها على مدار 24 ساعة بي اليرقات سابقة التجهيز أظهرت معنويا (P = 0.0066، المفردة T-اختبار) انخفاض وفيات. تمثل نتائج شركة طيران الشرق الأوسطن من أربعة في تجارب مستقلة ± الانحراف المعياري مع 10 يرقات لكل حالة. الرقم 3. التصوير المناعي البروتينات المستجيب في hemocytes المستخرج. انتزعت Hemocytes من اليرقات المصابة مع L. كانت ملطخة المستروحة 130B WT أو Δ DOTA معربا عن 4HA-صدق 41-918 في 5 ساعة خلايا بي استخدام الألغام المضادة للHA (الحمراء)، ومكافحة البكتيريا (الأخضر) الأجسام المضادة والحمض النووي وصمة عار دابي (الأزرق) لتصور النوى. ولوحظ 4HA-صدق 41-918 WT المحيطة بها، ولكن ليس Δ DOTA، والبكتيريا. شريط النطاق 5 ميكرون. الشكل 4. L. المستروحة يعيد داخل G. ميلوNELLA بطريقة دوت / آي سي إم تعتمد. أصيب اليرقات مع المستروحة WT أو Δ DOTA L. وعلى 0، 5، 18، و 24 ساعة بي الدملمف من ثلاثة الحشرات المصابة المجمعة، مطلي على لوحات CYE وتحديد كفو و تطبيع لقيحة ووزن الدملمف المستخرج. WT L. المستروحة تكرارها على مدى التجربة في حين تمت تبرئة سلالة Δ DOTA في غضون 18 ساعة بي النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة ± الانحراف المعياري. الرقم 5. عدوى مع WT L. النتائج المستروحة في تدمير كرية دموية كبيرة. انتزعت Hemocytes في 5، 18، و 24 ساعة من بي اليرقات المصابة مع المستروحة WT أو Δ DOTA L. خلايا قابلة للحياة وعدها باستخدام عدادة الكريات. لا فرق فيواعتبر عدد من الخلايا في 5 ساعة بي بين سلالات ولكن في 18 ساعة بي يبقى سوى 15٪ تقريبا من hemocytes في اليرقات المصابة بسلالة WT مقارنة مع سلالة Δ DOTA. النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة، ​​± الانحراف المعياري.

Discussion

غاليريا mellonella نموذج اليرقات لعدوى البكتيريا المستروحة هو أداة مفيدة لفي الدراسات المجراة المرضية. هنا يظهر أن عددا من جوانب العدوى البلاعم يمكن تلخيصها في G. نموذج mellonella، بما في ذلك دور نقطة / آي سي إم T4BSS في الفوعة وتكرار البكتيرية وتوطين دوت / آي سي إم-المستجيب صدق. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر أن المانع من الأكتين البلمرة الكيميائية يقلل بشكل ملحوظ وفيات اليرقات، ومحاكاة النتائج التي تم الحصول عليها في 47 macophages والأدلة المؤيدة التي تدخيل البكتيريا هو مطلوب ليسبب وفيات اليرقات. سابقا، وقد ثبت أن الاختلافات في الفوعة بين L. سلالات المستروحة ينظر في النماذج عدوى أخرى يمكن التحقق منها في G. مطلوب mellonella وأن تحريض عوامل الفوعة في مرحلة النمو بعد الأسي ل الفوعة البكتيرية <suع> 36، مؤكدا أن G. mellonella هو نموذج مناسب لL. عدوى المستروحة.

تحديد كفو من L. المستروحة من اليرقات المصابة إما منفردة أو التهابات مختلطة يزيد كثيرا من فائدة هذا النموذج. سابقا، وقد تم اكتشاف العديد من العوامل التي لها آثار خفية على النسخ المتماثل البكتيرية في نماذج واحدة أو أكثر من العدوى 29،48-51. على الرغم من أن اليرقات لا تمتلك نظام المناعة التكيفية، وجود استجابة مناعية فطرية يوفر اختيار أقوى مقارنة الضامة وحدها، والتي قد تؤدي إلى تضخيم الظواهر خفية. وبالتالي، فمن الممكن أنه في حين أن هذه السلالات ربما لن تؤثر بشكل كبير وفيات اليرقات، فإنها قد تثبت انخفض تكرار البكتيرية أو اللياقة البدنية في G. نموذج mellonella. وكذلك تكرار L. المستروحة في اليرقات، لقد أظهرنا استنزاف كرية دموية كبيرة في وقت متأخر من العدوى. كما L.ومن المتوقع أن ليز الخلايا المضيفة في نهاية دورة النسخ المتماثل الخاص به، وقياس نضوب كرية دموية قد تكون أيضا بمثابة القياس غير المباشر النسخ المتماثل البكتيرية المستروحة. وقد سبق أن ارتبط مع نضوب كرية دموية فيات الحشرات في العدوى 3،52، على الرغم من أن النتائج الأخيرة تشير إلى أن هذه الصورة هي أكثر تعقيدا من الأولى belived 37. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن تجويع اليرقات يؤدي إلى زيادة التعرض للإصابة من خلال قمع الاستجابات المناعية 53. في المقايسات وصفها هنا، واليرقات لا يتغذى طوال مدة الدراسة وليس من المعروف جيدا كيف اليرقات تتغذى سترد على L. عدوى المستروحة.

واحدة من مزايا G. mellonella كما كائن النموذج هو سهولة استخراج والكمي للhemocytes من اليرقات المصابة. وقد أظهرت أشرطة الفيديو السابقة أساليب مختلفة لاستخراج hemocytes من الحشرات 54،55 ومع ذلك، فإن التقىهود المقدمة هنا هي بسيطة ومناسبة لمعالجته فورا. مرة واحدة المستخرج، hemocytes يمكن قياسها كميا بسهولة، وتستخدم لالمناعي، المجهر الإلكتروني النافذ 36 أو 56 أو التدفق الخلوي مثقف وأصاب فيفو السابقين 3 السماح للاستجابة الخلايا للإصابة ليتم التحقيق في التفاصيل. هذا يزيد بشكل كبير من المرونة للنموذج. واحد التحذير إلى المناعي في G. mellonella هو إمدادات محدودة من الأجسام المضادة ضد التحقق من صحة G. البروتينات mellonella. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات خلق أجسام مضادة ضد بروتينات اليرقات 57 و الأجسام المضادة ضد البروتينات المرتبطة المناعة البشري عثر على الاعتراف G. البروتينات mellonella 11 مما يدل على إمكانية المناعي على G. hemocytes mellonella.

سهولة G. يسمح للعدوى mellonella السريع، شاشات الإنتاجية المتوسطة التي يمكن أنيمكن استخدامها لمقارنة الفوعة من مختلف الأنواع والسلالات والبكتيريا يمكن استخدامها لمزيد من تحليل عوامل الفوعة التي سبق تحديدها مثل جزيئات الالتصاق 58 أو نظام إفراز نوع 2 59 التي مطلوبة من أجل الفوعة في نماذج أخرى. بالإضافة إلى ذلك، سوف استخدام هذا النموذج تسمح بتحديد وتوصيف مزيد من عوامل الفوعة الرواية بما في ذلك يفرز وtranslocated البروتينات المستجيب. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن فسفوليباز النشاط C من L. المستروحة له دور في G. mellonella الفوعة 60 والمطلوب من البروتين المستجيب دوت / آي سي إم SdhA لالفوعة 37. بالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن هناك علاقة بين الظواهر التي لوحظت في G. وmellonella في الماوس سلالة A / J 37.

هذا يؤكد قيمة هذه الأداة لتكمل الأوالي البيئية وحيدة الخلية المضيفة ومورينماذج العدوى شمال شرق. وزاي سوف نموذج mellonella تصبح أكثر قيمة في المستقبل، وبمجرد أن التسلسل الجيني اليرقات وسوف تكون متاحة ويتم وضع المزيد من الأدوات الجينية. وتشمل الخطوات في هذا الاتجاه الذي نشر مؤخرا تفاصيل Transcriptome على المناعية ذات الصلة 61 وتشكيل مبادرة للنهوض إسكات الجينات في قشريات الجناح النيابة 62.

باستخدام G. mellonella اليرقات، لدينا عدد من بسيطة، قراءات السريع لالفوعة البكتيرية التي يمكن استخدامها لتحقيق التسبب في L. المستروحة. إنشاء هذه المقايسات وفحص أوسع من L. سوف سلالات المستروحة والمصليين زيادة فائدة هذه الأداة الجديدة، وسوف تسهم في فهمنا لL. المستروحة المرضية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد CR هاردينغ من قبل studentship WT086724 يلكوم ترست.

Materials

Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution*
*add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) Sigma P6526 0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution Sigma C7880 3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms) Livefood UK W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) Sigma H9037
Anti-Legionella LPS Cambridge Biosciences PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488 Jackson Immunoreach 711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) Sigma D8662
Paraformaldehyde Agar Scientific R1026
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma A9434
Trypan Blue solution Sigma T8154
Digitonin Sigma D141
Cytochalasin D Biomol International BML-T109-0001
[header]
Material
Microtiter Syringe Sigma 24544
Cell counter, double, Improved Neubauer VWR 631-0926
Centrifuge For centrifuging plates
Fluorescence microscope Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope For viable cell counting
Puncture-proof glove Turtleskin
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
  2. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  3. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
  4. Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
  5. Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
  6. Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
  7. Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
  8. Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
  9. Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
  10. Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
  11. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
  12. Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
  13. Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  14. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  15. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  17. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  18. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  19. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 (2011).
  20. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
  21. Horwitz, M. A. The Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
  22. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
  23. Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
  24. Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires’ disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
  25. Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires’ disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
  26. Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
  27. Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
  28. Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
  29. Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216 (2010).
  30. Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
  31. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  32. Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
  33. Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
  34. Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
  35. Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
  36. Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
  37. Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
  38. Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
  39. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392 (2012).
  40. Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
  41. Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
  42. Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
  43. Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
  44. Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46 (2006).
  45. Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
  46. Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
  47. Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
  48. Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
  49. Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
  50. Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
  51. Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
  52. Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
  53. Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
  54. Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772 (2011).
  55. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173 (2012).
  56. Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
  57. Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
  58. Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
  59. Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
  60. Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
  61. Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  62. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).

Tags

Galleria MellonellaLegionella PneumophilaInfection ModelHemocytesPhagocytesDot/Icm Type IV Secretion SystemLegionella Containing VacuoleBacterial VirulenceCompetition Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection. J. Vis. Exp. (81), e50964, doi:10.3791/50964 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image