JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Использование<em> Галерея MELLONELLA</em> В качестве модельного организма по изучению<em> Легионелл</em> Инфекция

Published: November 22, 2013
doi:
10.3791/50964
, , ,
1Center for Molecular Bacteriology and Infection,Imperial College London

Summary

Личинка восковой моли Galleria MELLONELLA недавно был создан в качестве естественных условиях модели в изучения легионелл инфекции. Здесь мы демонстрируем основные методы, чтобы охарактеризовать патогенез Legionella у личинок, в том числе прививки, измерения бактериальной вирулентности и репликации, а также извлечения и анализа зараженных гемоциты.

Abstract

Легионелл, возбудителем тяжелой пневмонии имени болезнь легионеров, является важным патоген человека, который заражает и повторяет в альвеолярных макрофагов. Его вирулентность зависит от секреции типа IV системы Dot / ICM (T4SS), что очень важно для установления репликации разрешительный вакуоль известный как Legionella, содержащего вакуоли (LCV). L. легионелл инфекции могут быть смоделированы на мышах, однако большинство штаммов мыши не разрешительный, что приводит к поиску новых моделей инфекции. Недавно мы показали, что личинки восковой моли Galleria MELLONELLA подходят для исследования L. легионелл инфекции. Г. MELLONELLA все чаще используется в качестве модели инфекции для человека возбудителей и хорошая корреляция существует между вирулентности нескольких видов бактерий в насекомое и в моделях млекопитающих. Ключевым компонентом иммунной защиты личинок являются гемоциты, профессияаль фагоциты, которые занимают и уничтожить захватчиков. L. легионелл способен инфицировать, образуют LCV и репликации в этих клетках. Здесь мы показываем, протоколы для анализа L. легионелл вирулентность в G. MELLONELLA модель, в том числе, как вырастить инфекционных L. легионелл, предварительной обработки личинок с ингибиторами, заразить личинок и как извлечь инфицированные клетки для количественного и иммунофлюоресценции микроскопии. Мы также опишем, как количественно бактериальной репликации и фитнеса в конкурентных анализах. Эти подходы позволяют быстрого скрининга мутантов, чтобы определить факторы, важные в L. легионелл вирулентности, описывая новый инструмент, чтобы помочь наше понимание этой сложной патогена.

Introduction

Животные модели инфекции оказались бесценными при определении бактериальных факторов вирулентности. Тем не менее, беспозвоночных модели отмечается повышенный интерес в качестве жизнеспособной альтернативы традиционным моделям млекопитающих инфекции. Личинки восковой моли, Галерея MELLONELLA все чаще используется для изучения ряд важных человеческих патогенов, в том числе грамположительных 1 и грамотрицательных бактерий 2,3 и несколько патогенных грибков 4,5. Использование модель насекомых имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными моделями млекопитающих, как беспозвоночных, G. MELLONELLA не подлежит этических ограничений моделей млекопитающих. Кроме того, личинки могут быть легко поддерживать, инфицированных путем инъекции без анестезии, пройти предварительную обработку с химических ингибиторов 6 и поддерживать инкубации при 37 ° С 7. Интересно, что хорошая корреляция между патогенностью нескольких микроорганизмов в G. Мелlonella и модели млекопитающих инфекции было установлено 2,8. Более глубокое понимание иммунной системы G. MELLONELLA также оказала помощь в характеристике этого модельного организма. Хотя насекомые не имеют адаптивную иммунную систему, которые содержатся в млекопитающих, у них есть сложные клеточные и плечевые оборону включая производство антимикробных пептидов 9. Гемоциты являются основным медиатором сотовых оборону и являются наиболее многочисленными тип клеток нашли в гемолимфе (или крови) группы G. MELLONELLA 10, Эти клетки профессиональные фагоциты и выполняют сходные функции, чтобы человека макрофагов и нейтрофилов обоими занимая и унижающего бактерий в фаго-лизосомные отсека 10,11 и формирования узелки вокруг вторжения бактерий, физически ограничивая бактериальной репликации 12.

Легионелл это респираторное патогенный микроорганизм, который вызывает сильную pneumoni(Болезнь легионеров) у восприимчивых групп населения, таких как пожилые люди или ослабленным иммунитетом 13. Legionella найден повсеместно в обоих экологических и техногенных источников воды, где это возбудитель различных видов пресноводных амеб 14,15. Legionella выживает и повторяет в этих профессиональных фагоцитов с использованием мульти-белкового комплекса известного как Dot / ICM (дефект торговли органелл / внутриклеточный умножения) введите 4 секреции систему (T4SS) транслоцироваться более 275 эффекторные белки в клетке-хозяине 16-20. Эти белки служат для подрыва нормальные пути клетка-хозяин фагоцитарные, что приводит к созданию Legionella, содержащего вакуоли (LCV). LCV позволяет избежать слияния с лизосомах, а вместо этого набирает эндоплазматический ретикулум (ER), полученных везикул, в результате специализированного отсеке, который напоминает грубую ER 21,22. L. легионелл считается случайным человеком путьоген; те же стратегии, которые позволяют ему применять их в рамках амеб, также позволяют репликацию в человека альвеолярных макрофагов 23.

Млекопитающих хозяева были охарактеризованы в качестве моделей для инфицирования человека Legionella включая мышей и морских свинок 24,25. Тем не менее, большинство линий мышей устойчивы к инфекции Legionella 26, за исключением инбредной альбиноса A / J мышей, который развивает мягкий, самоограничения инфекцию 24. Хотя модель морской свинки больше напоминает человеческую болезнь 25, отсутствие мутантов и увеличение стоимости препятствует их использование 27. Кроме того, несколько беспозвоночных модели были разработаны для легионелл инфекции включая Caenorhabditis Элеганс 28, Дрозофилы 29 и несколько видов амеб 30-32. Тем не менее, эти модели имеют слабые стороны, вирулентность в С. Элеганс </em> Система не Dot / ICM-зависимой 28, что ограничивает полезность этой модели. Модель дрозофилы доказала свою эффективность в расследовании бактериальной вирулентности факторы 29 и, кажется, обещая однако, эта модель не была полностью характеризуется. Одноклеточные амебы являются экологические хозяева L. легионелл и идеально подходят для исследования действия факторов вирулентности на молекулярном уровне 33, однако не хватает нескольких важных медиаторов млекопитающих ответ клетки-хозяина к инфекции, такие как каспазы 34. Слабость существующих моделей, наряду с высокой стоимостью и этических проблем, связанных с экспериментов млекопитающих, привело к поиску других соответствующих модельных организмов 29,35.

Недавно мы показали, что Г. MELLONELLA является подходящей моделью для L. легионелл патогенез 36,37. Подробнее Этот протокол экспериментальные методы, используемые для заразитьIng G. MELLONELLA личинки, анализируя личинок мораль, извлечение гемоциты для подсчета и иммунофлюоресценции и определения репликации по жизнеспособного КОЕ считает от зараженного личинками.

Protocol

1. Подготовка L. легионелл для инфекции Подготовка уголь дрожжевого экстракта (Cye) Плиты (2 г / л активированного угля, 10 г / л дрожжевого экстракта, 13 г / л агара, 10 г / л N-(2-ацетамидо)-2-aminothanesulfonic кислоты (ACE), 1 г / л α-кетоглутарат, 0,4 г / л L-цистеин HCl и 0,25 г / л железа пирофосфат, рН 6,9). Примечание: Если необходимо, добавить канамицин (25 мкг / мл) и / или хлорамфеникол (6 мкг / мл) в CYE пластин. Провести все L. легионелл работа на защитной биобезопасности уровня 2 (BSL-2) в микробной безопасности кабинета (MSC) в соответствии с местными правилами. Подряд Л. легионелл от -80 ° C глицерина запасов на Cye пластин Планшеты инкубируют в течение 4 дней при 37 ° С Примечание: Инкубирование пластин в течение 4 дней значительно увеличивает вирулентность L. легионелл в G. MELLONELLA над инкубации в течение 3-х дней. За день до инфекции, ресуспендируйте одну петлю фуLL бактерий (содержащий несколько колоний) в 1 мл предварительно нагретого (37 ° C) ACES дрожжевой экстракт (Ай) бульон и измеряют поглощение при 600 нм (OD 600) с помощью спектрофотометра. Привить свежий 3 мл AYE культуры (с антибиотиками, если требуется) до конечной OD 600 0.1. Включите СМИ только контролировать, чтобы обеспечить стерильность СМИ. Инкубировать при 37 ° С в инкубаторе при встряхивании 200 оборотов в минуту в течение 21 часов. Примечание: Бактерии должны быть выращены в пост-экспоненциальной фазе заражения 38. Рост в течение 21 ч. позволяет эксперименты быть стандартизированы. Примечание: Если требуется для индукции белка, добавьте 0,5 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в течение ночи. Измерьте OD 600 (бактерии должны быть в пост-экспоненциальной фазе роста, OD 600 2,5-3). Развести бактериальной культуры с получением 1 х 10 9 КОЕ / мл в фосфатно-солевом буфере Дульбекко стерильного (D-PBS). Примечание: На основе предыдущих результатов, OD 600 из 1 соответствует 1 × 10 9 КОЕ / мл, однако это должно быть подтверждено при различных L. штаммы Pneumophila. Примечание: если индукция белка из плазмиды требуется добавить 1 мМ IPTG до посева. Plate посевной, как описано в разделе 9 в качестве контроля, чтобы обеспечить ожидаемый КОЕ присутствует в посевного. 2. Подготовка личинок Покупка, достаточным G. MELLONELLA личинок от коммерческого поставщика. Личинки поставляются на стадии 5-й или 6-й возрастной стадии (примерно между 2-3 см в длину) и подходят для использования сразу. Примечание: Метод, описывающую, как в задней личинки была описана ранее 39. Примечание: Личинки можно хранить при комнатной температуре в течение до двух недель и не требуют еды. Сразу отказаться от любых личинок, показывая признаки окукливания. Подготовьте контейнер для личинки путем размещенияING круг 10 см фильтровальную бумагу на дне тарелки 10 см Петри. Использование тупых дают чаевые пинцет, разместить десять здоровый личинки примерно одинакового размера в чашке Петри. Примечание: Откажитесь нездоровые коричневые цвета или пятнистые глядя насекомых. Здоровый личинки равномерно сливочным цветные, без областях темной окраски и способны использовать свое право быстро, если перевернулся. 3. Заражение G. MELLONELLA Личинки Подготовка платформу впрыска лентой кружок фильтровальной бумаги на поверхность. Надежно лента наконечник P1000 горизонтально на фильтровальную бумагу, чтобы создать впрыска платформы. Это не должны быть стерильными. Стерилизовать 20 мкл микротитровальный шприц путем аспирации 70% этанола и инкубации в течение не менее 10 мин. Носите прокол доказательство перчатки во время инъекций, Удалить все остатки этанола путем аспирации и изгнав стерильную воду несколько раз. Усинг от шприцев, аспирация 10 мкл L. легионелл 1 х 10 9 КОЕ / мл суспензии. Возьмите одну личинку и мягко, но твердо включите его на спину, наклонился кончике P1000. Поместите кончик шприца над передней, правой proleg личинок. Осторожно, вставьте кончик иглы в proleg, убедившись, что он находится внутри личинок, и плавно вводят все содержимое шприца. Примечание: Если шприц вставлена ​​правильно, она должна быть возможность подобрать личинки, используя только шприц, чтобы поместить его в камеру. После инъекции, наблюдать личинок в течение нескольких секунд. Личинки начнет ползать через пару секунд, но не должны выделять жидкость. Кратко наблюдать личинок несколько часов после заражения; инфекции с 10 7 КОЕ L. легионелл 130b не вызывает никаких симптомов в течение первого 5-8 ч пи Поэтому, если личинки превращаются серый / черный до этого момента, тон эксперимент должен быть прекращен. Примечание: Прививка личинок с 1 мМ IPTG не влияет на жизнеспособность личинок в течение всего эксперимента. Таким же образом, вводят в общей сложности 10 личинок в состоянии, включая 10 личинок, инъецированных D-PBS, чтобы служить в качестве контроля для анализа личинок смертности. Ленточные чашки Петри закрыта и место в вторичной защитной оболочки. Инкубировать в стандартном бактериальной инкубаторе при 37 ° С, в течение всего срока эксперимента. 4. Предварительная обработка личинок с химического ингибитора До инфекции, подготовить личинок для инъекций, как описано в разделе 3.1-3.6. Введите 10 мкл 100 мкМ раствора цитохалазина D в переднюю, оставил proleg 10 личинок. Примечание: Ингибитор вводят в другом proleg от бактериальной суспензии уменьшить вред личинок. Введите 10 мкл ДМСО в 10 личинок в качестве контроля. Выдержите личинок на37 ° C в течение 4 часов. Введите предварительно обработанного личинок, как описано в разделе 3 в передней правой proleg либо 1 х 10 7 КОЕ WT L. легионелл или управления ФСБ. 5. Анализ личинок смертности В 18 ч после заражения (пи), изучить все зараженные личинки для смертности. Для проверки смертности, используйте тупые дают чаевые пинцет, чтобы перевернуть личинок и отыскать движения ног, здоровый личинки должны наделить себя быстро. Пигментация указывает на сильную иммунную реакцию к инфекции. Если есть движение, считаются живыми. Рекордное число мертвых и живых личинок. Повторите этот процесс во всех остальных точках времени выбрали. Примечание: Если инкубацию продолжают в течение более трех дней, куколки можно увидеть. Удалите куколок и усыпить замораживанием при – 20 ° С до может произойти метаморфозы. 6. Добыча гемолимфы Случайно выбрать триЛичинки и поместить в 14 мл трубки на отдельных временных точках, таких как 5 и 18 час пи, Поместите эту трубку на льду в течение 5-10 мин, до тех пор пока не наблюдается никакого движения ноги личинок. Поместите наркозом личинок на чашку Петри и, используя скальпель, сделать надрез между двумя сегментами возле хвоста личинок. Сжать личинок в стерильный 1,5 мл центрифужную пробирку для сбора гемолимфы. Бассейн гемолимфы, по крайней мере трех человек. Один личинки дает между 15-50 мкл гемолимфы в зависимости от размера. Примечание: Во время извлечения гемолимфы это очень легко сорвать кишечник, в результате чего потенциального загрязнения образцов. Уменьшить загрязнение путем разрезания личинки около хвоста (от кишечнике), однако, выбор антибиотика всегда будет требоваться при покрытие из бактерии. Примечание: Для предотвращения гемолимфу от потемнения и коагулянты, обработать гемолимфу в течение 10 мин после сбора. Откажитесь от тела личинки в новый 14 мл трубки сокола, печатью и месте – 20 ° С в течение ночи, чтобы обеспечить личинки мертвы. Автоклав мертвых личинок и распоряжаться в соответствии с местными правилами. 7. Определение Hemocyte Жизнеспособность Выписка гемолимфу, как описано выше. Смешать 20 мкл гемолимфы, извлеченной с 20 мкл 0,02% (объем / объем) трипанового синего в ФБР в одну лунку 96-луночного планшета. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Нагрузка 10 мкл гемолимфы на гемоцитометре и считать жизнеспособных (не синие) клетки. Всего каждый образец в трех экземплярах, чтобы уменьшить ошибку. 8. Переработки добываемых Гемоциты для иммунофлуоресценции микроскопии Смешайте вариант объединенного гемолимфы, извлеченный из по меньшей мере три личинок и пипеткой на 10-15 мм покровным стеклом в 24-луночный планшет. Примечание: Покровные не требуют лечения, как гемоциты может придерживаться стекла. Добавить 0,5 мл D-PBS и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Центрифуга пластину в течение 10 мин при 500 х г при комнатной температуре (RT) с использованием Аэрозольнепроницаемый держатель центрифуга пластины. Осмотрите каждую лунку с помощью инвертированного микроскопа, чтобы проверить, что гемоциты придерживались. Удалить супернатант и тщательно промыть клетки три раза путем добавления 0,5 мл D-PBS к стенке скважины, раскачивание пластина 2-3X и удаление D-PBS с помощью пипетки. Зафиксировать клетки добавлением 0,5 мл 4% (объем / объем) параформальдегида (PFA) в PBS. Инкубируйте клетки для между 20-30 мин при комнатной температуре. Промыть клетки трижды D-PBS, как описано выше. Добавить 0,5 мл 15 мМ NH 4 Cl в PBS, чтобы погасить остаточный PFA и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Промыть клетки трижды D-PBS. Примечание: На данном этапе, покровные можно хранить в течение ночи при 4 ° С. Добавить 0,5 мл 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР ​​и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре к проницаемыми клеток. </li> Блок течение 1 часа блокирующим раствором (2% (вес / объем) BSA в PBS). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте с первичным антителом, разведенным в блокирующем растворе при разведении указанной изготовителем. Вымойте 3x с PBS. Инкубировать в течение 1 часа со вторичным антителом и DAPI для визуализации бактерий, как указано выше. Вымойте 3x с PBS. Установите покровные используя одну каплю монтажа реагента на стеклах. Выдержите в течение ночи в темноте при комнатной температуре, чтобы полностью высохнуть монтажную решение. Изображение скользит по флуоресцентным микроскопом. 9. Количественное определение бактериального КОЕ Добавить 100 мкг / мл спектиномицин чтобы CYE пластины, чтобы избежать загрязнения кишечной флоры. Л. штамм легионелл 130b является естественной устойчивостью к спектиномицину 40. Перед добычи гемолимфы, весят 1,5 мл центрифужные пробирки. Выписка гемолимфу, как описано в разделе 6 и поместите в взвешенного ти массовые рассылки, добавить 1 мкл 5 мг / мл дигитонина, хорошо перемешать и инкубировать 5 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать гемоциты. Взвешивают трубку с гемолимфы и определить вес гемолимфы извлеченный. Выполните десять раз серийные разведения гемолимфе в стерильной AYE СМИ. Использование пера, разделите базу в CYE пластины на шесть равных секторов и этикетке. Пластинчатые три капли 25 мкл каждого разведения (начиная с наиболее разбавленных) в каждом разделе пластины. Инкубируйте пластин с крышками в крайнее положение в течение ночи при 37 ° С После того, как капли высохли полностью повернуть тарелку и инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере еще двух дней. Количественно бактерии, извлеченные путем подсчета колоний при каждом разведении и нормализации веса гемолимфы извлечены. 10. Определение Конкурсной индекс (СИ) Убедитесь, что оба штамма расти одинаково хорошо в бульонной культуры и CYE агар пластин PRIOг в попытке конкурентную индекс. Подготовка WT или канамицину мутантные бактериальные суспензии, как описано в разделе 1 и смешать в соотношении 1:1. Пластинчатые серийные разведения посевного на CYE спектиномицина (100 мкг / мл) и CYE спектиномицин / канамицин Заразить личинок и экстракт гемолимфу в соответствующих временных точках, как описано выше. Определить жизнеспособных микроорганизмов путем извлечения гемолимфу и последовательных растворов на CYE спектиномицина и CYE спектиномицину / канамицина. Рассчитайте конкурентное индекс (CI) следующим образом: CI = (мутант выход / WT выход) / (мутант посевной / WT посевной).

Representative Results

Здесь показано, что Г. MELLONELLA является подходящим, простой в использовании моделью для изучения L. легионелл инфекции. Ранее было показано, что L. легионелл вирулентность в макрофагах, амебы и моделей млекопитающих зависит от наличия системы секреции Dot / ICM 41-43. Г. MELLONELLA личинки были инфицированы, как описано выше, и вирулентность дикого типа (WT) и Dot / ICM-дефицитный штамм сравнивать. Заражение 10 7 КОЕ L. штамм легионелл 130b привело к 100% смертности в течение 24 ч после заражения (PI). Тем не менее, L. легионелл Δ Dota штамм, который не имеет функциональную систему секреции Dot / Icm T4SS, был авирулентным в этом анализе (рис. 1). Это показывает, что Л. легионелл вирулентность в G. MELLONELLA зависит от транслокации Dot / ICM эффекторов, что делает эта модель подходит для характеристикиФункция этих белков. Недавно было показано, что ингибирование фагоцитоза путем обработки цитохалазином увеличили susceptibly личинок к инфекции дрожжей Candida Albicans 6. Как L. легионелл является внутриклеточным патогеном, было принято решение, чтобы определить, поглощение бактерий имеет решающее значение в патогенезе в этой модели. Личинки предварительно обрабатывали 10 мкл 100 мкМ цитохалазином D (CyD) в течение 4 ч при 37 ° С, затем инфицировали 10 7 КОЕ L. WT легионелл 130b и смертность контролируется на 24 часами пи лечение одним ингибитора не влияет личиночной выживаемости. Тем не менее, предварительно, инфицированных личинок отображается значительно большую выживаемость (р = 0,0066, непарный Т-тест) по сравнению с ДМСО обработанных, инфицированных насекомых (рис. 2). Эффект лечения CyD было отменено на 48 час пи (результаты не показаны), что может быть связано с периодом полураспада препарата в G.MELLONELLA. Это показывает, что поглощение L. легионелл в G. MELLONELLA гемоциты является одним из важнейших аспектов бактериальной вирулентности. В целях подтверждения выражение и определить субклеточной локализацию эффекторной белка в G. MELLONELLA, гемоциты были извлечены и обработаны для иммунофлуоресценции микроскопии. Личинки были инфицированы WT и Δ Dota L. легионелл 130b выражая фрагмент четко определенной T4SS эффектора, SIDC 41-918, слитого с 4 N-концевых тегов ГК. Это было продемонстрировано эффектор для связывания LCV через фосфоинозитид-4-фосфат-связывающим доменом 44. Использование анти-Ха (красный) и анти-Legionella (зеленый) антител, 4HA-SIDC 41-918 локализованную на LCV в инфицированных гемоциты (рис. 3). Эта локализация Ранее было показано в discoideum амебы Dictyostelium и в макрофагах млекопитающих 44,45 подтверждающих грomparability этой модели. Важность белков для вирулентности обычно определяется путем сравнения кинетики роста дикого типа и мутантных бактерий. Для того чтобы проследить бактериальных кинетику репликации по ходу инфекции, три личинки были умерщвлены в каждый момент времени (0, 5, 18 и 24 ч PI), гемолимфы собирают и объедин ют и CFU/0.1g добываемой гемолимфы определяется. После первоначального падения на 5 ч пи, КОЕ бактерий WT увеличивается до 24 час пи однако, штамм Δ DotA не подвергается репликации и очищается на 18 час пи (рис. 4). Способность L. легионелл, чтобы вызвать лизис макрофагов в T4SS-зависимым образом уже давно документально 46, однако аналогичные исследования были проведены в естественных условиях. Концентрация циркулирующих гемоцитов определяли при 5, 18 и 24 часа личинки пи были инфицированы WT или Δ <eм> Dota Л. легионелл 130b, гемоциты извлеченные из инфицированных насекомых и жизнеспособных клеток, подсчитанных с помощью трипанового синего метод исключения. На 5 ч пи никакой разницы в гемоцитов отсчетов между штаммами не было видно (рис. 5). Тем не менее, в 18 час пи произошло значительное падение концентрации гемоцитов в WT, но не Δ DotA, инфицированных личинок. Эта разница сохраняется в 24 час пи падение числа гемоцитов, в сочетании с наличием внутриклеточных бактерий, как показано с помощью иммунофлуоресценции, предполагает, что L. легионелл повторяет в гемоциты то лизирует их, позволяя бактериям пройти несколько раундов репликации. Рисунок 1. Заражение L. легионелл вызывает Dot / ICM зависит от личиночной смертности. 10 личинки были инфицированы PBS в одиночку или 10 <sдо> 7 КОЕ дикого типа (WT) или Δ DOTA L. Pneumophila 130b, инкубировали при 37 ° С в течение 72 ч и в момент смерти личинок записаны. Все личинки инфицированы WT поддался инфекции в течение 24 ч после заражения (пи), однако не смертности не наблюдалось у личинок инокулированного только PBS или штамма Δ DotA. Результаты являются средними из трех отдельных экспериментов, ± стандартное отклонение. Рисунок 2. Смертность зависит от бактериальной интернализации. 10 л легионелл личинки предварительно обрабатывали 10 мкл 100 мкМ цитохалазином D (CyD) в течение 4 ч при 37 ° С, затем инфицированного 10 7 WT и смертности контролируют при 24 ч пи предварительной обработке личинок значительно показано (P = 0,0066, непарный т-тест) снижение смертности. Результаты представляют МЭСп в четырех независимых экспериментов ± стандартного отклонения с 10 личинок на состоянии. Рисунок 3. Иммунофлуоресценции изображений эффекторных белков в извлеченных гемоциты. Гемоциты были извлечены из личинок, инфицированных L. легионелл 130b WT или Δ Dota выражая 4HA-SIDC 41-918 на 5 час пи клетки окрашивали с помощью анти-Ха (красный) и анти-Legionella (зеленый) антител и пятно ДАПИ ДНК (синий) для визуализации ядер. 4HA-SIDC 41-918 наблюдалось окружающую WT, но не Δ DotA, бактерии. Шкала бар 5 мкм. Рисунок 4. Л. легионелл повторяет в G. МеллоНелла в Dot / ICM-зависимым образом. Личинки были инфицированы WT или Δ Dota Л. Pneumophila и в 0, 5, 18, ​​и 24 часа в сутки пи гемолимфа из трех зараженных насекомых объединенных, высевали на Cye пластин и КОЕ определяется и нормированной на инокулята и весу гемолимфы извлечены. WT Л. легионелл реплицируются в течение эксперимента в то время как штамм Δ DOTA был очищен в течение 18 ч пи Результаты являются средними из трех отдельных экспериментов ± стандартное отклонение. Рисунок 5. Заражение WT L. Результаты Pneumophila в значительному разрушению гемоцитов. Гемоциты добывались на 5, 18 и 24 часа в сутки пи из личинок, инфицированных WT или Δ Dota Л. Pneumophila и жизнеспособных клеток, подсчитанных с помощью гемоцитометра. Нет разницы вКоличество клеток было видно на 5 ч пи между штаммами однако на 18 ч пи только около 15% гемоцитов остаются в личинок, инфицированных штаммом WT сравнению со штаммом Δ DOTA. Результаты являются средними из трех отдельных экспериментов, ± стандартное отклонение.

Discussion

Галерее MELLONELLA личинок модель для легионелл инфекции является полезным инструментом для в естественных условиях исследования патогенеза. Здесь показано, что ряд аспектов макрофагов инфекции может быть обобщены в G. MELLONELLA модель, в том числе роли Dot / Icm T4BSS в вирулентности и бактериальной репликации и локализации Dot / ICM-эффекторной SIDC. Кроме того, мы показываем, что химический ингибитор полимеризации актина значительно снижает личинок смертности, имитируя результаты, полученные в macophages 47 и подтверждающие доказательства, что интернализация бактерий требуется, чтобы вызвать личинок смертности. Ранее было показано, что вариации в вирулентности между L. штаммы Pneumophila видели в других моделях инфекции может быть проверена в G. MELLONELLA и что индукция факторов вирулентности в пост-экспоненциальной фазе роста требуется для бактериальной вирулентности <suр> 36, подтверждая, что Г. MELLONELLA является подходящей моделью для L. легионелл инфекции.

Определение КОЕ L. легионелл из личинок инфицированных по отдельности или в смешанных инфекций значительно повышает полезность модели. Ранее несколько факторов были обнаружены, что имеют тонкие эффекты на бактериальной репликации в одной или нескольких моделей инфекции 29,48-51. Хотя личинки не обладают адаптивной иммунной системы, наличие врожденного иммунного ответа обеспечивает более высокий выбор по сравнению с только макрофагами, что может служить для усиления тонкие фенотипы. Таким образом, не исключено, что, в то время как эти штаммы, вероятно, не оказывает существенного влияния личинок смертности, они могут демонстрировать уменьшилось бактериальной репликации или пригодность в G. MELLONELLA модель. А также репликация L. легионелл в личинок, мы показали значительное истощение гемоцитов в конце инфекции. Как L.легионелл, как ожидается, чтобы лизировать клетки-хозяева, в конце своего цикла репликации, измерение истощение гемоцитов может также служить в качестве косвенного измерения бактериальной репликации. Истощение Hemocyte ранее коррелирует со смертностью от насекомых в инфекции 3,52, хотя недавние результаты показывают, что эта картина является более сложной, чем первая верили 37. Недавно было показано, что голодание личинок приводит к повышенной восприимчивости к инфекции путем подавления иммунного ответа 53. В анализах, описанных здесь, личинки не кормили в течение всего срока исследования и не известно, насколько хорошо кормили личинок будет реагировать на L. легионелл инфекции.

Одним из преимуществ G. MELLONELLA в качестве модельного организма является простота добычи и количественной оценки гемоциты от зараженных личинок. Предыдущее видео показали различные методы для извлечения гемоциты от насекомых 54,55 однако, встретилисьХод представлены здесь проста и подходит для немедленной обработки. После извлечения гемоцитов могут быть легко количественно, используемый для иммунофлуоресцентного, просвечивающей электронной микроскопии 36 или проточной цитометрии 56 или культивируют и инфицированных исключая виво 3 позволяя ответ клеток к инфекции, которые будут подробно исследованы. Это значительно повышает гибкость модели. Одно предостережение иммунофлюоресцентного в G. MELLONELLA является ограниченное предложение антител сверяются с G. MELLONELLA белки. Тем не менее, исследования показали, создание антител против личиночных белков 57 и антител против белков человека, связанных с иммунной были найдены признать G. MELLONELLA белки 11, демонстрирующие потенциал для иммунофлуоресценции на G. MELLONELLA гемоциты.

Легкость G. MELLONELLA инфекции позволяет быстро, средних экранов пропускной которые могутиспользоваться для сравнения вирулентность различных Legionella видов и штаммов и могут быть использованы для дальнейшего анализа ранее определенных факторов вирулентности, такие как молекул адгезии или 58 системы 59 типа 2 секреции, которые требуются для вирулентности в других моделях. Кроме того, использование этой модели позволит идентификацию и дополнительную характеристику новых факторов вирулентности в том числе и секретируемых перемещаться эффекторных белков. Недавно было показано, что фосфолипазы С активность L. легионелл играет важную роль в G. MELLONELLA вирулентности 60 и что эффектор белок Dot / Icm SdhA требуется для вирулентности 37. Кроме того, мы недавно показали, что существует корреляция между фенотипами наблюдаемых в G. MELLONELLA и в линии мышей / J 37.

Это подчеркивает ценность этого инструмента в дополнение к экологической простейших и одноклеточных хозяина и Muriпе инфекции модели. Г. MELLONELLA модель станет еще более ценным в будущем, после того, как личиночной геномная последовательность будет доступна и более генетические инструменты устанавливаются. Шаги в этом направлении включают недавнюю публикацию с подробным иммунную связанных транскриптома 61 и формирование инициативой продвижения молчание генов в Lepidoptera SPP 62.

Используя G. MELLONELLA личинки, у нас есть ряд простых, быстрых показаний бактериальной вирулентности, которые можно использовать для изучения патогенеза L. легионелл. Создание этих анализов и широкого скрининга L. штаммы Pneumophila и серогрупп увеличит полезность этого нового инструмента и будет способствовать нашему пониманию L. легионелл патогенез.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CR Хардинг была поддержана студенчества WT086724 Wellcome Trust.

Materials

Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution*
*add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) Sigma P6526 0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution Sigma C7880 3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms) Livefood UK W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) Sigma H9037
Anti-Legionella LPS Cambridge Biosciences PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488 Jackson Immunoreach 711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) Sigma D8662
Paraformaldehyde Agar Scientific R1026
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma A9434
Trypan Blue solution Sigma T8154
Digitonin Sigma D141
Cytochalasin D Biomol International BML-T109-0001
[header]
Material
Microtiter Syringe Sigma 24544
Cell counter, double, Improved Neubauer VWR 631-0926
Centrifuge For centrifuging plates
Fluorescence microscope Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope For viable cell counting
Puncture-proof glove Turtleskin
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
  2. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  3. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
  4. Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
  5. Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
  6. Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
  7. Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
  8. Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
  9. Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
  10. Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
  11. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
  12. Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
  13. Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  14. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  15. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  17. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  18. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  19. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 (2011).
  20. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
  21. Horwitz, M. A. The Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
  22. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
  23. Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
  24. Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires’ disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
  25. Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires’ disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
  26. Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
  27. Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
  28. Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
  29. Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216 (2010).
  30. Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
  31. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  32. Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
  33. Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
  34. Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
  35. Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
  36. Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
  37. Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
  38. Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
  39. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392 (2012).
  40. Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
  41. Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
  42. Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
  43. Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
  44. Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46 (2006).
  45. Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
  46. Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
  47. Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
  48. Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
  49. Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
  50. Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
  51. Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
  52. Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
  53. Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
  54. Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772 (2011).
  55. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173 (2012).
  56. Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
  57. Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
  58. Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
  59. Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
  60. Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
  61. Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  62. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).

Tags

Galleria MellonellaLegionella PneumophilaInfection ModelHemocytesPhagocytesDot/Icm Type IV Secretion SystemLegionella Containing VacuoleBacterial VirulenceCompetition Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection. J. Vis. Exp. (81), e50964, doi:10.3791/50964 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image