JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Gebruik<em> Galleria mellonella</em> Als modelorganisme om te studeren<em> Legionella pneumophila</em> Infectie

Published: November 22, 2013
doi:
10.3791/50964
, , ,
1Center for Molecular Bacteriology and Infection,Imperial College London

Summary

De larve van de wasmot Galleria mellonella werd onlangs opgericht als een in vivo model om Legionella pneumophila infectie te bestuderen. Hier tonen we basistechnieken de pathogenese van Legionella karakteriseren de larven, zoals inoculatie meting van bacteriële virulentie en replicatie en extractie en analyse van geïnfecteerde hemocytes.

Abstract

Legionella pneumophila, de verwekker van een ernstige longontsteking genaamd veteranenziekte, is een belangrijke menselijke pathogeen die infecteert en repliceert in alveolaire macrofagen. De virulentie afhankelijk Dot / Icm type IV secretiesysteem (T4SS), dat essentieel is voor replicatie tolerante vacuole bekend als Legionella bevattende vacuole (LCV) vast. L. pneumophila infectie kan worden gemodelleerd in muizen maar de meeste muizen stammen zijn niet tolerant, wat leidt tot de zoektocht naar nieuwe infectie modellen. We hebben onlangs aangetoond dat de larven van de wasmot Galleria mellonella zijn geschikt voor onderzoek van L. pneumophila infectie. G. mellonella wordt steeds meer gebruikt als een infectie model voor humane pathogenen en een goede correlatie bestaat tussen virulentie van verschillende bacteriële soorten in de insecten en zoogdieren modellen. Een belangrijk onderdeel van het immuunsysteem van het afweersysteem van het larven zijn hemocytes, beroepal fagocyten, die nemen en te vernietigen indringers. L. pneumophila kan infecteren, vormen een LCV en repliceren in deze cellen. Hier laten we protocollen voor het analyseren L. pneumophila virulentie in G. mellonella model, met inbegrip van hoe om te groeien besmettelijke L. pneumophila, voorbehandelen de larven met remmers, infecteren de larven en hoe om geïnfecteerde cellen te extraheren voor kwantificering en immunofluorescentie microscopie. We beschrijven ook hoe om bacteriële replicatie en fitness kwantificeren competitietesten. Deze aanpak kan de snelle screening van mutanten factoren van belang L. bepalen pneumophila virulentie, het beschrijven van een nieuw instrument om ons begrip van deze complexe pathogeen helpen.

Introduction

Diermodellen infectierisico onschatbare waarde gebleken bij de bepaling van bacteriële virulentie factoren. Echter, invertebrate modellen verhoogde aandacht gekregen als een levensvatbaar alternatief voor de traditionele zoogdierlijke modellen van infectie. De larven van de was mot wordt Galleria mellonella steeds vaker gebruikt om een aantal belangrijke menselijke pathogenen, waaronder grampositieve 1 en Gram-negatieve bacteriën en 2,3 verscheidene pathogene fungi 4,5 bestuderen. Met een insect model heeft een aantal voordelen ten opzichte van zoogdierlijke modellen, als ruggegraat, G. mellonella is niet onderworpen aan de deontologische beperkingen van zoogdieren modellen. Bovendien kunnen de larven makkelijk onderhouden, geïnfecteerd door de injectie anesthesie ondergaan voorbehandeling met chemische remmers 6 en sustain incubatie bij 37 ° C 7. Interessant is dat een goede correlatie tussen de pathogeniciteit van diverse micro-organismen in G. mellonella en zoogdieren modellen van de infectie is vastgesteld 2,8. De toegenomen begrip van het immuunsysteem G. mellonella heeft ook geholpen bij de karakterisering van dit modelorganisme. Hoewel insecten niet een adaptieve immuunsysteem hebben als de in zoogdieren, ze hebben geavanceerde cellulaire en humorale afweer waaronder de productie van antimicrobiële peptiden 9. Hemocytes zijn de belangrijkste bemiddelaar van cellulaire afweer en zijn de meest talrijke celtype gevonden in de hemolymfe (of bloed) van G. mellonella 10, Deze cellen zijn professionele fagocyten en soortgelijke functies menselijke macrofagen en neutrofielen door zowel toegang tot en afbrekende bacteriën in een phago-lysosomale compartiment 10,11 en die nodules rondom binnendringende bacteriën, fysiek beperken bacteriële replicatie 12.

Legionella pneumophila is een respiratoire pathogeen dat ernstige pneumoni veroorzaakteen (veteranenziekte) bij gevoelige bevolkingsgroepen zoals ouderen of immuungecompromitteerde 13. Legionella is alomtegenwoordig in zowel milieu als kunstmatige waterbronnen, waar het een pathogeen van de verschillende soorten van zoet water amoeben 14,15. Legionella overleeft en repliceert binnen deze professionele fagocyten met behulp van een multi-eiwit complex bekend als Dot / Icm (defect in organel handel / intracellulaire vermenigvuldiging) type 4 secretiesysteem (T4SS) tot meer dan 275 effector eiwitten verplaatsen in de gastheercel 16-20. Deze eiwitten dienen om de normale gastheercel fagocytaire trajecten ondermijnen, wat leidt tot de oprichting van de Legionella bevat vacuole (LCV). De LCV vermijdt fusie met lysosomen, maar werft endoplasmatisch reticulum (ER)-afgeleide blaasjes, waardoor een gespecialiseerde compartiment waarin de ruwe ER 21,22 lijkt. L. pneumophila wordt beschouwd als een toevallige menselijke padOgen, dezelfde strategieën die toelaten om repliceren amoeben, replicatie in humane alveolaire macrofagen 23 ook mogelijk.

Zoogdiergastheren zijn gekarakteriseerd als modellen voor de menselijke legionellabesmetting waaronder muizen en cavia's 24,25. De meeste muizenstammen zijn tegen Legionella infectie 26 met uitzondering van de ingeteelde albino A / J muis, die een milde, zelfbeperkende infectie 24 ontstaat. Hoewel het caviamodel meer lijkt menselijke ziekte 25 het ontbreken van mutanten en verhoogde kosten ontmoedigt het gebruik 27. Bovendien zijn verscheidene ruggegraat modellen ontwikkeld voor Legionella pneumophila infectie, waaronder Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 en verschillende soorten amoeben 30-32. Echter, deze modellen hebben zwakheden, virulentie in de C. elegans </em> Systeem is niet Dot / Icm-afhankelijke 28, het beperken van het nut van dit model. Het Drosophila model effectief onderzoek bacteriële virulentiefactoren 29 en lijkt echter veelbelovend gebleken, dit model is niet volledig gekarakteriseerd. Eencellige amoeben zijn de milieu-gastheren van L. pneumophila en zijn ideaal voor onderzoek naar de werking van virulentiefactoren op moleculair niveau 33 ontbreekt echter een aantal belangrijke mediatoren van de zoogdierlijke gastheercel op infectie zoals caspases 34. De zwakke punten van de bestaande modellen, samen met de hoge kosten en ethische problemen met betrekking tot zoogdieren experimenten, heeft geleid tot het zoeken naar andere geschikte modelorganismen 29,35.

We hebben onlangs aangetoond dat G. mellonella is een geschikt model voor L. pneumophila pathogenese 36,37. Dit protocol beschrijft de experimentele technieken die worden gebruikt voor infecting G. mellonella larven, analyseren larvale moraal, extraheren hemocytes voor het tellen en immunofluorescentie en het bepalen van replicatie door levensvatbare CFU telt van geïnfecteerde larven.

Protocol

1. Bereiding van L. pneumophila voor Infectie Bereid houtskool gistextract (CYE) platen (2 g / l actieve kool, 10 g / L gistextract, 13 g / l agar, 10 g / L N-(2-aceetamido)-2-aminothanesulfonic acid (ACES), 1 g / L α-ketoglutaraat, 0,4 g / l L-cysteïne HCl en 0,25 g / L ferripyrofosfaat, pH 6,9). Opmerking: Indien nodig, voeg kanamycine (25 ug / ml) en / of chlooramfenicol (6 ug / ml) platen Cye. Voer alle L. pneumophila werk op bioveiligheid inperkingsniveau 2 (BSL-2) in een microbiële veiligheidskabinet (MSC) in overeenstemming met de lokale regels. Streak L. pneumophila van -80 ° C glycerol voorraden op CYE platen Incubeer de platen gedurende 4 dagen bij 37 ° C. Opmerking: Incubatie van de platen gedurende 4 dagen verhoogt de virulentie van L. pneumophila in G. mellonella dan incubatie gedurende 3 dagen. Een dag voor de infectie, resuspendeer een lus full bacteriën (die verscheidene kolonies) in 1 ml voorverwarmde (37 ° C) ACES gistextract (AYE) bouillon en meet de absorptie bij 600 nm (OD600) met een spectrofotometer. Inoculeer een nieuwe 3 ml AYE kweek (met antibiotica indien nodig) tot een OD 600 van 0,1. Onder andere een media alleen de controle om de steriliteit van de media te waarborgen. Incubeer bij 37 ° C in een incubator schudden bij 200 rpm gedurende 21 uur. Opmerking: Bacteriën moeten worden gekweekt om post-exponentiële fase voor besmetting 38. Groeiende 21 uur laat experimenten worden gestandaardiseerd. Opmerking: Indien vereist voor eiwit inductie, voeg 0,5 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) overnacht. Meet de OD 600 (bacteriën moeten in post-exponentiële groeifase, OD 600 2.5-3). Verdun bacteriekweek tot 1 x 10 9 CFU / ml in steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) werd verkregen. Noot: Gebaseerd op eerdere resultaten een OD600 van 1 correspondeert met 1 x 10 9 CFU / ml, maar dit moet worden bevestigd verschillende L. pneumophila stammen. Opmerking: indien inductie van een eiwit uit een plasmide vereist, voeg 1 mM IPTG aan het inoculum. Plate het inoculum zoals beschreven in hoofdstuk 9 als een controle om ervoor te zorgen de verwachte CFU aanwezig in het inoculum is. 2. Voorbereiding van Larven Aankoop voldoende G. mellonella larven van een commerciële leverancier. Larven worden verstuurd in stap 5 e of 6 e instar (tussen ongeveer 2-3 cm lang) en zijn geschikt voor gebruik direct. Opmerking: Een methode beschrijft hoe aan de achterzijde larven eerder 39 beschreven. Opmerking: Larven kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende twee weken geen voedsel nodig. Eventuele larven tekenen van verpopping meteen weggooien. Bereid de container voor larve door Placing een cirkel van 10 cm filtreerpapier op de bodem van een 10 cm Petrischaal. Met behulp van stompe getipt pincet, plaats tien gezonde larven van ongeveer vergelijkbare grootte in de petrischaal. Opmerking: Gooi ongezonde bruin gekleurd of vlekkerige zoek insecten. Gezonde larven worden gelijkmatig crèmekleurige zonder gebieden van donkere verkleuring en zijn in staat om zich snel goed als omgedraaid. 3. Infectie van G. mellonella Larven Bereid de injectie platform met tape een cirkel van filterpapier aan de oppervlakte. Stevig tape een P1000 tip horizontaal naar filterpapier om een ​​injectie platform. Dit hoeft niet steriel te zijn. Steriliseren een 20 pl microtiter spuit door afzuigen 70% ethanol en incuberen gedurende ten minste 10 minuten. Draag punctie handschoenen tijdens het injecteren, Verwijder eventuele resterende ethanol door opzuigen en het verdrijven van steriel water een paar keer. Using de injectiespuit, aspireren 10 ul van de L. pneumophila 1 x 10 9 CFU / ml suspensie. Neem een ​​larve en voorzichtig maar stevig zet hem op zijn rug, gebogen over de P1000 tip. Plaats de punt van de spuit via de voorzijde, recht proleg van de larven. Voorzichtig, steek de punt van de naald in de proleg, om ervoor te zorgen dat het binnen de larven, en soepel injecteren van de inhoud spuit. Opmerking: Als de injectiespuit correct is geplaatst, moet het mogelijk zijn te halen de larven met alleen de injectiespuit te plaatsen in de kamer. Na injectie, acht de larven voor een paar seconden. De larven zal beginnen te kruipen na een paar seconden, maar mag niet scheiden vloeistof. Kort observeren de larven een paar uur na infectie, infectie met 10 7 CFU L. pneumophila 130b geen symptomen binnen de eerste 5-8 uur pi veroorzaken Dus als larven draaien grijs / zwart voordat dit punt, thij experiment moet worden gestaakt. Opmerking: Enten van larven met 1 mM IPTG geen invloed larvale levensvatbaarheid in de loop van het experiment. Op dezelfde wijze injecteren in totaal 10 larven per conditie waaronder 10 larven geïnjecteerd met D-PBS te dienen als controle voor larvale mortaliteit analyseren. Tape petrischalen gesloten en plaats in de secundaire insluiting. Incubeer in een standaard bacteriële incubator bij 37 ° C, gedurende de duur van het experiment. 4. Voorbehandeling van Larven met een Chemische Inhibitor Voorafgaand aan infectie, bereiden larven voor injectie zoals beschreven in paragraaf 3.1-3.6. Injecteer 10 pi van een 100 pM oplossing van cytochalasine D in de voorste, linker proleg van 10 larven. Opmerking: Inhibitor wordt geïnjecteerd in een andere proleg van bacteriesuspensie tot letsel aan de larven. Injecteer 10 pl DMSO in 10 larven als controle. Incubate larven aan37 ° C gedurende 4 uur. Injecteren voorbehandeld larven zoals beschreven in hoofdstuk 3 aan de voorzijde, rechts proleg met ofwel 1 x 10 7 CFU van WT L. pneumophila of een PBS-controle. 5. Analyse van Larvale Mortality Op 18 uur na infectie (pi), onderzoekt alle besmette larven voor sterfte. Sterfte controleren, gebruiken stompe getipt pincet om te draaien de larven en kijk voor beweging van de benen, moeten gezonde larven zich snel rechts. Pigmentatie duidt op een sterke immuunreactie op infectie. Als er een beweging, tellen als levend. Record aantal dode en levende larven. Herhaal dit proces op alle andere tijdstippen gekozen. Opmerking: Als incubatie wordt gedurende meer dan drie dagen, kan poppen zichtbaar. Verwijder alle poppen en euthanaseren door invriezen bij – 20 ° C voordat metamorfose kan optreden. 6. Extractie van Hemolymfe Selecteert willekeurig drielarven en plaats in een 14 ml buis op geselecteerde tijdstippen zoals 5 en 18 uur pi, Plaats deze buis op ijs gedurende 5-10 minuten, totdat er geen beweging van de benen van de larven worden waargenomen. Plaats de verdoofde larven op een petrischaaltje, met een scalpel een insnijding tussen twee segmenten nabij de staart van de larven. Knijp de larven in een steriele 1,5 ml centrifugebuis om hemolymph verzamelen. Pool hemolymph uit ten minste drie personen. Een larven geeft tussen 15-50 ul van hemolymph afhankelijk van de grootte. Opmerking: Bij hemolymfe extractie is zeer gemakkelijk om de darm te verstoren, waardoor potentiële contaminatie van monsters. Verminder verontreiniging door snijden van de larven bij de staart (weg van de darm) zal echter antibioticumselectie altijd vereist wanneer plating het bacteriën. Opmerking: Om hemolymph voorkomen dat ze bruin en coaguleren, proces hemolymph binnen 10 minuten na afname. Gooi de larvale lichaam in een nieuwe 14 ml Falcon buis, afdichting en plaats bij – 20 ° C gedurende de nacht om ervoor te zorgen de larven dood. Autoclaveer dode larven en afvoeren volgens de lokale regels. 7. Bepaling van hemocyte Viability Hemolymfe extract zoals hierboven beschreven. Meng 20 pi hemolymfe geëxtraheerd met 20 ui 0,02% (v / v) trypan blauw in PBS in een putje van een plaat met 96 putjes. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Belasting 10 ul van hemolymph op een hemocytometer en tel levensvatbaar (niet blauw) cellen. Tellen elk monster in drievoud naar fouten te verminderen. 8. Verwerking van Extracted hemocytes voor immunofluorescentiemicroscopie Meng de gepoolde hemolymph gewonnen uit ten minste drie larven en pipet op een 10-15 mm glas dekglaasje in een 24-well plaat. Opmerking: Dekglaasjes geen behandeling nodig als hemocytes kan hechten aan glas. Voeg 0,5 ml van D-PBS en meng goed door en neer te pipetteren. Centrifugeer de plaat gedurende 10 min bij 500 xg bij kamertemperatuur (RT) met een hermetische centrifuge plaathouder. Onderzoek elk putje met behulp van een omgekeerde microscoop om te controleren of de hemocytes hebben gehandeld. Verwijder de supernatant en was voorzichtig de cellen drie keer door toevoeging van 0,5 ml D-PBS aan de wand van de put, het schommelen van de plaat 2-3x en de D-PBS verwijderd met een pipet. Fixeer de cellen door toevoeging van 0,5 ml van 4% (v / v) paraformaldehyde (PFA) in PBS. Incubeer de cellen gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen drie keer met D-PBS, zoals voorheen. Voeg 0,5 ml 15 mM NH4Cl in PBS resterende PFA lessen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was de cellen drie keer met D-PBS. Opmerking: In dit stadium kan de dekglaasjes nachts bewaard bij 4 ° C. Voeg 0,5 ml 0,1% Triton X-100 in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur aan cellen permeabilize. </li> Blok 1 uur met blokkerende oplossing (2% (w / v) BSA in PBS). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker met het primaire antilichaam verdund in blokkerende oplossing bij de verdunning die door de fabrikant. Was 3x met PBS. Incubeer gedurende 1 uur met het secundaire antilichaam en DAPI voor de visualisering van bacteriën kiezen. Was 3x met PBS. Monteer de dekglaasjes met behulp van een druppel montage reagens op glasplaatjes. Incubeer overnacht in het donker bij kamertemperatuur tot de montage oplossing volledig drogen. Beeld schuift op een fluorescentiemicroscoop. 9. Kwantificering van bacteriële CFU Voeg 100 ug / ml spectinomycine platen Cye verontreiniging door de darmflora voorkomen. L. pneumophila stam 130b is van nature resistent tegen spectinomycine 40. Voordat hemolymph extractie, weeg 1,5 ml centrifuge buizen. Extract hemolymph zoals beschreven in hoofdstuk 6 en plaatsen in woog tubes, voeg 1 pl van 5 mg / ml digitonine, meng en incubeer gedurende 5 min bij RT hemocytes lyseren. Weeg de buis met hemolymfe en bepalen het gewicht van hemolymfe gewonnen. Voer tienvoudige seriële verdunningen van de hemolymfe in steriele AYE media. Met behulp van een pen, verdeel de voet van een CYE plaat in zes gelijke sectoren en label. Plaat drie druppels van 25 pi van elke verdunning (te beginnen met de meest verdund) in elke sectie van de plaat. Incubeer de platen met de deksels allergrootste overnacht bij 37 ° C. Zodra de druppels volledig zijn gedroogd, draai de plaat over en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste nog eens twee dagen. Kwantificeer de bacteriën door het tellen van de kolonies bij elke verdunning geëxtraheerd en normaliseren van het gewicht van hemolymfe geëxtraheerd. 10. Bepaling van het Competitive Index (CI) Bevestigen dat beide stammen groeien even goed in bouillon cultuur en op CYE agarplaten prior om te proberen de concurrentie-index. Bereid WT of kanamycineresistente mutant bacteriesuspensies zoals beschreven in paragraaf 1 en meng in een 1:1 verhouding. Plaat seriële verdunningen van het inoculum op CYE spectinomycine (100 ug / ml) en spectinomycine CYE / kanamycine Infect larven en hemolymfe extract op geschikte tijdstippen zoals hierboven beschreven. Bepaling van levensvatbare tellingen door het extraheren hemolymph en plating seriële verdunningen op CYE spectinomycine en CYE spectinomycin / kanamycine. Bereken de competitieve index (CI) als volgt: BI = (mutant output / WT uitgang) / (mutant inoculum / WT inoculum).

Representative Results

Hier wordt aangetoond dat G. mellonella is een geschikte, gemakkelijk te gebruiken model om L. te studeren pneumophila infectie. Eerder is aangetoond dat L. pneumophila virulentie in macrofagen, amoeben en zoogdiermodellen is afhankelijk van de aanwezigheid van de Dot / Icm secretiesysteem 41-43. G. mellonella larven geïnfecteerd zoals hierboven beschreven en de virulentie van het wildtype (WT) en een Dot / Icm-deficiënte stam vergeleken. Infectie met 10 7 CFU van L. pneumophila stam 130b resulteerde in 100% sterfte binnen 24 uur bericht infectie (pi). De L. pneumophila Δ DOTA-stam, die geen functioneel Dot / Icm T4SS secretiesysteem heeft, is avirulent in dit assay (figuur 1). Dit toont aan dat L. pneumophila virulentie in G. mellonella hangt af van de translocatie van Dot / Icm effectoren, waardoor dit model geschikt voor de karakterisering vande functie van deze eiwitten. Recent werd aangetoond dat remming van fagocytose door cytochalasine behandeling verhoogde de susceptibly van de larven infectie door de gist Candida albicans 6. Zoals L. pneumophila is een intracellulaire pathogeen, werd besloten om te bepalen of de opname van de bacterie is cruciaal in de pathogenese van dit model. Larven werden voorbehandeld met 10 ul van 100 uM cytochalasine D (CyD) gedurende 4 uur bij 37 ° C, vervolgens geïnfecteerd met 10 7 CFU WT L. pneumophila 130b en mortaliteit gecontroleerd 24 uur pi behandeling met de remmer alleen had geen invloed larvale overleving. Echter, voorbehandeld, geïnfecteerde larven weergegeven significant grotere overleving (p = 0,0066, ongepaarde t-toets) vergeleken met DMSO behandelde, geïnfecteerde insecten (figuur 2). Het effect van CyD behandeling werd afgeschaft 48 uur pi (resultaten niet getoond), dit kan te wijten zijn aan de halfwaardetijd van het geneesmiddel in G.mellonella. Dit toont aan dat opname van L. pneumophila in G. mellonella hemocytes is een cruciaal aspect van bacteriële virulentie. Om expressie te valideren en bepalen de subcellulaire lokalisatie van een effector eiwit in G. mellonella, hemocytes werden geëxtraheerd en verwerkt voor immunofluorescentie microscopie. Larven werden geïnfecteerd met WT en Δ DOTA L. pneumophila 130b expressie brengen van een fragment van de goed gedefinieerde T4SS effector, SIDC 41-918, gefuseerd tot 4 N-terminale HA markeringen. Deze effector werd aangetoond dat de LCV binden via een fosfoinositide-4-fosfaat-bindende domein 44. Het gebruik van anti-HA (rood) en anti-legionella (groen) antilichamen, 4HA-SIDC 41-918 gelokaliseerd in het LCV in geïnfecteerde hemocytes (figuur 3). Deze aanwijzing is eerder in de amoeben Dictyostelium discoideum en in zoogdierlijke macrofagen 44,45 bevestiging van de comparability van dit model. Het belang van eiwitten voor virulentie wordt gewoonlijk bepaald door de kinetica van wildtype en mutante bacteriën. Om de bacteriële replicatie kinetiek in de loop van de infectie te volgen werden drie larven gedood op elk tijdstip (0, 5, 18 en 24 uur pi), de hemolymfe verzameld en samengevoegd en de CFU/0.1g onttrokken hemolymfe bepaald. Na een duik in 5 uur pi, de CFU van de WT bacteriën toeneemt tot 24 uur pi echter de Δ DOTA stam ondergaat geen replicatie en verwijdering op 18 uur pi (figuur 4). Het vermogen van L. pneumophila lysis van macrofagen veroorzaken een T4SS afhankelijke wijze al lang gedocumenteerd 46 echter geen soortgelijke studies uitgevoerd in vivo. De concentratie van circulerende hemocytes werd bij 5, 18 en 24 uur pi Larven werden geïnfecteerd met WT of Δ <em> DOTA L. pneumophila 130b, hemocytes geëxtraheerd uit geïnfecteerde insecten en levensvatbare cellen geteld met behulp van de trypanblauwexclusie methode. Op 5 uur pi geen verschil in hemocyte tellingen tussen de stammen te zien (Figuur 5). Echter, op 18 uur pi was er een significante daling hemocyte concentratie WT, maar niet Δ DOTA geïnfecteerde larven. Dit verschil bleef na 24 uur pi De daling hemocyte nummer, samen met de aanwezigheid van intracellulaire bacteriën zoals gezien door immunofluorescentie, stelt L. pneumophila repliceert binnen hemocytes dan lyseert hen, waardoor de bacteriën om een aantal rondes van replicatie ondergaan. Figuur 1. Infectie met L. pneumophila induceert Dot / Icm-afhankelijke larvale mortaliteit. 10 larven besmet waren met PBS alleen of 10 <sinschrijven> 7 CFU van wild-type (WT) of Δ Dota L. pneumophila 130b, geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 72 uur en het tijdstip van overlijden van de larven opgenomen. Alle larven besmet met het WT bezweken aan een infectie binnen 24 uur na infectie (pi), echter geen mortaliteit werd gezien bij larven ingeënt met PBS alleen of de Δ DotA stam. Resultaten zijn het gemiddelde van drie afzonderlijke experimenten ± standaardafwijking. Figuur 2. Sterfte is afhankelijk van bacteriële internalisatie. 10 L. pneumophila larven werden voorbehandeld met 10 ul van 100 uM cytochalasine D (CyD) gedurende 4 uur bij 37 ° C vervolgens geïnfecteerd met 10 7 WT en mortaliteit gecontroleerd 24 uur pi voorbehandeld larven aangetoond significant (P = 0,0066, ongepaarde T-test) verminderde sterfte. Resultaten vormen de mean van de vier onafhankelijke experimenten ± standaarddeviatie met 10 larven per conditie. Figuur 3. Immunofluorescentie beeldvorming van effector-eiwitten in uitgepakt hemocytes. Hemocytes werden geëxtraheerd uit larven besmet met L. pneumophila 130b WT of Δ DOTA uiten 4HA-SIDC 41-918 op 5 uur pi Cellen werden gekleurd met behulp van anti-HA (rood) en anti-legionella (groen) antilichamen en DAPI DNA vlek (blauw) om de kernen te visualiseren. 4HA-SIDC 41-918 werd waargenomen rondom WT, maar niet Δ Dota, bacteriën. Schaalbalk 5 micrometer. Figuur 4. L. pneumophila repliceert binnen G. mellonella in Dot / Icm-afhankelijke wijze. Larven werden geïnfecteerd met WT of Δ DOTA L. pneumophila en bij 0, 5, 18 en 24 uur pi de hemolymfe uit drie geïnfecteerde insecten samengevoegd, uitgeplaat op CYE platen en de CFU bepaald en genormaliseerd naar het inoculum en het gewicht van hemolymfe geëxtraheerd. WT L. pneumophila gerepliceerd in de loop van het experiment terwijl Δ DOTA ras binnen 18 uur pi resultaten is gewist zijn het gemiddelde van drie afzonderlijke experimenten ± standaardafwijking. Figuur 5. Infectie met WT L. pneumophila resulteert in aanzienlijke hemocyte vernietiging. hemocytes werden geëxtraheerd op 5, 18 en 24 uur pi van larven met WT of Δ DOTA L. pneumophila en levensvatbare cellen geteld met een hemocytometer geïnfecteerd. Geen verschil in deaantal cellen werd in 5 uur pi tussen de stammen gezien echter op 18 uur pi slechts ongeveer 15% van hemocytes blijven larven geïnfecteerd met WT-stam vergeleken met de Δ DotA stam. Resultaten zijn het gemiddelde van drie afzonderlijke experimenten ± standaardafwijking.

Discussion

De Galleria mellonella larvale model voor Legionella pneumophila-infectie is een handig hulpmiddel voor in vivo studies van de pathogenese. Hier wordt aangetoond dat een aantal aspecten van macrofaag infectie kan worden samengevat in de G mellonella model, inclusief de rol van de Dot / Icm T4BSS in virulentie en bacteriële replicatie en de lokalisatie van de Dot / Icm-effector SIDC. Daarnaast tonen wij aan dat een chemische remmer van actine polymerisatie vermindert larvale mortaliteit nabootsen resultaten verkregen macophages 47 en bewijsmateriaal dat internalisatie van de bacteriën moet larvale mortaliteit veroorzaken. Eerder is aangetoond dat de verschillen in virulentie tussen L. pneumophila stammen gezien in andere infectiemodellen kunnen G. geverifieerd mellonella en inductie van virulentiefactoren in post-exponentiële groeifase vereist voor bacteriële virulentie <sup> 36, bevestigt dat G. mellonella is een geschikt model voor L. pneumophila infectie.

Bepaling CFU L. pneumophila van larven geïnfecteerd afzonderlijk of in gemengde infecties verhoogt de bruikbaarheid van het model. Eerder hebben verschillende factoren ontdekt dat subtiele effecten bacteriële replicatie in een of meer modellen van infectie 29,48-51 hebben. Hoewel de larven geen adaptieve immuunsysteem bezitten, de aanwezigheid van de aangeboren immuunrespons biedt betere keuze dan alleen macrofagen, die kunnen dienen om subtiele fenotypes amplificeren. Daarom is het mogelijk dat, terwijl deze stammen waarschijnlijk niet significant larvale mortaliteit beïnvloeden, kunnen zij aantonen verminderde bacteriële replicatie of geschiktheid in G. mellonella model. Naast replicatie van L. pneumophila in de larven, hebben we laten zien significante hemocyte uitputting laat in de infectie. Zoals L.pneumophila verwachting gastheercellen lyseren eind van zijn replicatiecyclus, meten hemocyte depletie kan ook dienen als een indirecte meting van bacteriële replicatie. Hemocyte uitputting eerder is gecorreleerd met insect sterfte bij infecties 3,52, hoewel de recente resultaten suggereren dat deze foto is veel complexer dan eerst belived 37. Onlangs is aangetoond dat honger larven leidt tot verhoogde gevoeligheid voor infectie door een onderdrukking van immuunresponsen 53. In de hier beschreven assays, werden larven gevoed gedurende de duur van de studie en het is niet bekend hoe goed gevoede larven zou reageren L. pneumophila infectie.

Een van de voordelen van G. mellonella als modelorganisme is het gemak van extractie en kwantificering van hemocytes uit besmette larven. Vorige video's getoond van verschillende methoden voor de extractie van hemocytes van insecten 54,55 echter de ontmoetinghod hier gepresenteerd is eenvoudig en geschikt voor onmiddellijke verwerking. Eenmaal geëxtraheerd kunnen hemocytes gemakkelijk worden gekwantificeerd voor immunofluorescentie, transmissie-elektronenmicroscopie 36 of flowcytometrie 56 of gekweekt en geïnfecteerd ex vivo 3 waardoor de respons van de cellen om infectie te onderzoeken in detail. Dit verhoogt aanzienlijk de flexibiliteit van het model. Een waarschuwing aan immunofluorescentie in G. mellonella is het beperkte aanbod van antilichamen gevalideerd tegen G. mellonella eiwitten. Studies hebben echter de vorming van antilichamen tegen larvale eiwitten 57 en antilichamen tegen humane immuun gerelateerde eiwitten aangetoond bleken G. herkennen mellonella eiwitten 11 demonstreren van de mogelijkheden voor immunofluorescentie op G. mellonella hemocytes.

Het gemak van G. mellonella infectie zorgt voor een snelle, medium throughput schermen die kunnenworden gebruikt voor het vergelijken van de virulentie van verschillende Legionella soorten en stammen, en kan worden gebruikt om verder te analyseren eerder geïdentificeerde virulentiefactoren zoals adhesiemoleculen 58 en type 2 secretiesysteem 59 die nodig zijn voor virulentie in andere modellen. Bovendien zal het gebruik van dit model de identificatie en verdere karakterisatie van nieuwe virulentiefactoren zoals afgescheiden en getransloceerd effector eiwitten toestaan. Onlangs is aangetoond dat de fosfolipase-C-activiteit van L. pneumophila heeft een rol in G. mellonella virulentie 60 en de Dot / Icm effectoreiwit SDHA is vereist voor virulentie 37. Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat er een correlatie tussen de waargenomen fenotypes G. mellonella en in de A / J muizen stam 37.

Dit onderstreept de waarde van deze tool om milieu protozoa en eencellige gastheer en muri aanvullenne infectie modellen. De G. mellonella model nog waardevoller worden in de toekomst, wanneer de larven genoomsequentie beschikbaar zijn en genetische hulpmiddelen worden vastgesteld. Stappen in deze richting zijn de recente publicatie waarin de immuun-gerelateerde transcriptome 61 en de vorming van een initiatief om gene silencing vooruit in Lepidoptera spp 62.

Door G. mellonella larven, hebben we een aantal eenvoudige, snelle uitlezing van bacteriële virulentie die kunnen worden gebruikt om de pathogenese van L. onderzoeken pneumophila. Oprichting van deze assays en bredere screening van L. pneumophila stammen en serogroepen zullen het nut van deze nieuwe tool te vergroten en zal bijdragen aan ons begrip van L. pneumophila pathogenese.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CR Harding werd gesteund door de Wellcome Trust studententijd WT086724.

Materials

Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution*
*add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) Sigma P6526 0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution Sigma C7880 3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms) Livefood UK W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) Sigma H9037
Anti-Legionella LPS Cambridge Biosciences PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488 Jackson Immunoreach 711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) Sigma D8662
Paraformaldehyde Agar Scientific R1026
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma A9434
Trypan Blue solution Sigma T8154
Digitonin Sigma D141
Cytochalasin D Biomol International BML-T109-0001
[header]
Material
Microtiter Syringe Sigma 24544
Cell counter, double, Improved Neubauer VWR 631-0926
Centrifuge For centrifuging plates
Fluorescence microscope Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope For viable cell counting
Puncture-proof glove Turtleskin
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
  2. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  3. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
  4. Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
  5. Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
  6. Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
  7. Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
  8. Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
  9. Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
  10. Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
  11. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
  12. Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
  13. Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  14. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  15. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  17. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  18. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  19. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 (2011).
  20. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
  21. Horwitz, M. A. The Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
  22. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
  23. Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
  24. Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires’ disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
  25. Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires’ disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
  26. Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
  27. Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
  28. Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
  29. Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216 (2010).
  30. Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
  31. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  32. Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
  33. Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
  34. Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
  35. Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
  36. Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
  37. Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
  38. Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
  39. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392 (2012).
  40. Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
  41. Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
  42. Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
  43. Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
  44. Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46 (2006).
  45. Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
  46. Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
  47. Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
  48. Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
  49. Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
  50. Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
  51. Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
  52. Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
  53. Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
  54. Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772 (2011).
  55. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173 (2012).
  56. Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
  57. Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
  58. Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
  59. Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
  60. Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
  61. Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  62. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).

Tags

Galleria MellonellaLegionella PneumophilaInfection ModelHemocytesPhagocytesDot/Icm Type IV Secretion SystemLegionella Containing VacuoleBacterial VirulenceCompetition Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection. J. Vis. Exp. (81), e50964, doi:10.3791/50964 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image