Seguimiento del comportamiento a largo plazo de Libremente Natación débilmente eléctrico Fish

Antecedentes. Experimentos cuantitativos sobre el comportamiento animal (por ejemplo, elección forzada, evitación de shock, laberinto en T, etc.) Se utilizan normalmente para investigar las hipótesis específicas relativas a las habilidades sensoriales y motoras, el aprendizaje y la formación de la memoria. Sin embargo, estos experimentos restrictivas se pierda gran parte de la riqueza del comportamiento natural de los animales, y es probable que resulte en modelos simplistas de la base neural subyacente de comportamiento. Los experimentos en condiciones más naturales son, por tanto, un complemento importante por el cual podemos explorar más a fondo el repertorio conductual especies. Los experimentos con animales se mueven libremente deben, sin embargo, frente a los desafíos técnicos únicos, tales como artefactos de grabación inducidas por movimiento. A diferencia de las respuestas de estímulo evocado, que se producen de manera espontánea el comportamiento exploratorio no se pueden predecir, por lo que los sujetos experimentales tienen que ser controlados y seguidos durante un período prolongado de tiempo constante. Las preguntas específicas de investigación can ser mejor abordados por organismos cuidadosamente seleccionados y las herramientas técnicas disponibles. Por ejemplo, las técnicas de registro y estimulación ópticos tales como sensores de calcio genéticamente codificados en ¹ y ² optogenética se han aplicado con éxito para moverse libremente organismos modelos genéticos ^3-5. Por otra parte, los sistemas de telemetría neuronales miniaturizados pueden grabar y estimular que se mueve libremente animales pequeños ^6,7.

Peces Electric. Especies WEF generan descargas eléctricas de órganos (EODs), que les permiten percibir su entorno inmediato o para comunicarse a grandes distancias. Los patrones temporales de EODs varían bajo diferentes condiciones tales como auto-movimientos ^8,9, estímulos sensoriales ^{10,11, 12,13} y las interacciones sociales. Especies WEF de tipo Pulso producen un tren de pulsos discretos, en lugar de especies de tipo de onda a la que generan formas de onda cuasi sinusoidal continua. En general, de tipo pulso exhiben especies more Tasa EOD variables en comparación con las especies de tipo de onda, y las tasas de eliminación de artefactos explosivos de los animales refleja de cerca el contenido de la novedad de su entorno sensorial ^10,14. Especies de tipo de pulso pueden reducir de inmediato el intervalo entre pulsos (IPI) en un solo ciclo de pulso en responder a una perturbación sensorial novela (respuesta novedad ^10,11,14). El comportamiento eléctrico continuo de estos peces puede ser perturbado por los estímulos sensoriales no controladas procedentes de fuentes externas, y diferentes tipos de estímulos tales como la vibración, el sonido, la electricidad y la luz son conocidas las respuestas de la novedad de activación. Por lo tanto, se deben tomar precauciones especiales para impedir o atenuar los estímulos sensoriales externos durante una observación a largo plazo de nado libre WEF. De esta manera, los cambios en la tasa de EOD y trayectorias de movimiento pueden ser atribuidos específicamente a los estímulos presentados por el experimentador.

Tanque de acuario y cámara de aislamiento. Por lo tanto, colocamos varias capas de materiales de absorción de vibraciones under un tanque del acuario grande (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), y rodearon el tanque con un recinto aislado para bloquear las fuentes externas de luz, ruido eléctrico, el sonido y el flujo de calor. Tasa de EOD depende de la temperatura que rodea ^15,16, por lo tanto la temperatura del agua fue estrechamente regulada en un intervalo de tropical (25 ± 1 ° C) para las especies de Sur América WEF. Construimos un (10 cm de profundidad de agua) tanque grande y poco profunda para observar conductas exploratorias espaciales del WEF restringidas principalmente en dos dimensiones (Figura 1A). El tanque se repartió en una pista central para observar comportamientos espaciales, y cuatro compartimentos de esquina para albergar por separado cada pez (Figura 1B). Cada compartimiento estanco fue construida para impedir la comunicación eléctrica entre los individuos. Acceso Animals 'a la arena central estaba controlada desde el exterior por cuatro compuertas motorizadas. Las puertas se colocaron entre los compartimentos, y se convirtieron hermético cuando está bloqueadopor nylon alas nueces. No hay partes metálicas se utilizaron bajo el agua desde WEF reaccionan sensiblemente a los metales.

Grabación EOD. EODs se generan de una manera estereotipada por la activación de un solo (en Mormyrids) o múltiples órganos eléctricos distribuidos espacialmente (en Gymnotiforms) ^17,18. Modulaciones temporales en la tasa del EOD pueden revelar las actividades neuronales de nivel superior, ya que el marcapasos medular recibe entradas neuronales directos de las regiones superiores del cerebro, tales como el núcleo prepacemaker diencefálico, que a su vez recibe las proyecciones axonales de la cerebro anterior ^19. Sin embargo, el momento del EOD debe ser cuidadosamente extraída de una grabación de forma de onda en bruto y no sesgada por las distorsiones inducidas por movimiento del animal. El campo eléctrico generado por una FEM se puede aproximar como un dipolo, por lo EOD amplitudes de pulso en electrodos de registro dependen de las distancias y orientaciones relativas entre el animal y los electrodos de ^8,20. Auto-movem del Animalpadres cambian la geometría relativa entre el animal y los electrodos, por lo tanto los movimientos causan las amplitudes EOD en diferentes electrodos para varían con el tiempo de una manera volátil (véase la Figura 2B en Junio ​​et al. ^8). Por otra parte, auto-movimientos también cambian la forma de onda EOD grabadas, porque las contribuciones relativas de diferentes conjunto de los órganos eléctricos dependen de sus ubicaciones a lo largo de la longitud del cuerpo y sus curvaturas locales introducida por la flexión de la cola. Las distorsiones inducidas por movimiento en las amplitudes y formas EOD pueden conducir a mediciones de tiempo EOD imprecisas y no fiables. Hemos superado estos problemas espacialmente promediando múltiples formas de onda de desactivación de artefactos explosivos registrados en distintos lugares, y añadiendo un filtro de extracción de sobres para determinar con precisión el momento del EOD de una FEM de nado libre. Además, nuestra técnica también mide las amplitudes de desactivación de artefactos explosivos, que indican si un animal está en reposo o moviéndose activamente basándose en el cambio de la EODamplitudes en el tiempo (véanse las figuras 2E y 2F). Se registraron señales diferencialmente amplificados a partir de los pares de electrodos de grabación para reducir el ruido de modo común. Dado que los pulsos de desactivación de artefactos explosivos se generan a intervalos de tiempo irregulares, el evento de series de tiempo EOD tiene una frecuencia de muestreo variable. El tiempo-serie del EOD se puede convertir a una velocidad de muestreo constante por interpolación si es requerido por una herramienta analítica de elección.

La grabación de vídeo. Aunque la grabación EOD puede supervisar una actividad de movimiento bruto de un animal, la grabación de vídeo permite la medición directa de la posición del cuerpo de un animal y la postura. Infrarrojo cercano (NIR) Iluminación (λ = 800 ~ 900 nm) permite imperturbable observación visual de nadar libremente peces ^21,22, ya WEFs son más activos en la oscuridad y sus ojos no son sensibles al espectro NIR ^23,24. La mayoría de los sensores de imagen digital (por ejemplo, CMOS o CCD) pueden capturar el espectro NIR con la wavelength rango entre 800-900 nm, después de la eliminación de un puerto de infrarrojos (IR) de filtro de bloqueo ^25. Ciertas webcams de nivel de consumidor de gama alta ofrecen alta definición, ángulo de visión amplio y una buena sensibilidad con poca luz, lo que puede producir una calidad de imagen comparable a, o superior a cámaras de infrarrojos de calidad profesional disponible a costos mucho mayores. Además, ciertos webcams de nivel de consumidor se incluyen con el software de grabación que permite un tiempo de grabación prolongado al comprimir vídeo sin pérdida de calidad. La mayoría de cámaras de nivel profesional ofrecen sincronización TTL salidas de impulsos de tiempo o entradas de pulsos TTL de disparo ²⁶ para alinear la sincronización entre el vídeo con las señales digitalizadas, pero esta característica es generalmente ausente en webcams de nivel de consumidor. Sin embargo, la temporización entre una grabación de vídeo y un digitalizador de señal se puede emparejar con precisión mediante la captura simultáneamente un IR LED parpadea periódicamente con la cámara y el digitalizador de señal. El momento inicial y la final del pulso IR se puede utilizar unas de dos marcadores de calibración de tiempo para convertir los números de fotogramas de vídeo a la unidad de tiempo digitalizador de señal y viceversa.

Iluminación y fondo. Imagen capturar a través del agua puede ser un desafío técnico debido a reflejos de luz en la superficie del agua. La superficie del agua puede actuar como un espejo para reflejar una escena visual por encima del agua, y las características visuales oscuros bajo el agua, por lo que la escena fuera del agua debe dictarse sin rasgos para evitar la interferencia visual. Con el fin de imagen todo el acuario, una cámara tiene que ser colocado directamente sobre el agua, y que debe estar oculto detrás del techo sobre un orificio de visualización pequeño para evitar su reflexión sobre la superficie del agua. Por otra parte, la superficie del agua puede producir miradas y la iluminación no uniforme si las fuentes de luz se proyectan de forma incorrecta. La iluminación indirecta puede lograr una iluminación uniforme sobre toda el acuario por objetivo las fuentes de luz hacia el techo, de tal manera que el techo y el Wal rodeals pueden reflejar y difundir los rayos de luz antes de llegar a la superficie del agua. Elija un iluminador de infrarrojos que coincide con una respuesta espectral de la cámara (por ejemplo, 850 nm de longitud de onda de pico). Ruido eléctrico de las fuentes de luz puede ser minimizado mediante el uso de luces LED y la colocación de sus fuentes de alimentación de corriente continua fuera de la jaula de Faraday. Coloque un fondo blanco debajo del tanque, ya que los peces contrasta bien en un fondo blanco en longitudes de onda NIR. Del mismo modo, el uso del color blanco mate en las superficies interiores de la cámara de aislamiento proporciona uniforme y brillante iluminación de fondo.

Seguimiento de vídeo. Después de una grabación de vídeo, un algoritmo de seguimiento automatizado de imágenes puede medir posiciones y posturas del cuerpo del animal con el tiempo. El seguimiento de vídeo se puede realizar de forma automática, ya sea software listo para usar (Viewpoint o Ethovision), o software programable por el usuario (OpenCV o MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imagen). Como el primer paso de seguimiento de imagen,un área de seguimiento válido tiene que ser definido por dibujar una forma geométrica para excluir la zona exterior (enmascarar la operación). A continuación, la imagen de un animal tiene que ser aislado del fondo restando una imagen de fondo de una imagen que contiene el animal. La imagen de la resta se convierte a un formato binario mediante la aplicación de un umbral de intensidad, de manera que el centroide y el eje de orientación se pueden calcular a partir de las operaciones morfológicas binarias. En Gymnotiforms ^27-29 y ^30-32 Mormyrids, la densidad electroreceptor es la más alta cerca de la región de la cabeza, por lo que la posición de la cabeza en cualquier momento indica una ubicación de la más alta agudeza sensorial. Los lugares de la cabeza y de la cola se pueden determinar de forma automática mediante la aplicación de las operaciones de rotación de imagen y de cuadro de límite. Los extremos de cabeza y cola se pueden distinguir uno del otro definiendo manualmente en el primer fotograma, y ​​por hacer el seguimiento de sus ubicaciones de la comparación de dos tramas sucesivas.